伤湿祛痛膏的UPLC-Orbitrap-MSn成分分析及其抗氧化、抗炎作用研究

陈扬，李朝峰，张雪，赵苑伶，刘妍，刘静，赵崇军，林瑞超，马志强*

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102）

类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，多见四肢关节滑膜炎，与T 淋巴细胞、Th1 细胞介导的免疫系统功能紊乱密切相关，致残率较高，急需强效的治疗策略［1-3］。伤湿祛痛膏记载于《中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第8册）》［4］，由生川乌、生草乌、麻黄、苍术、当归、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷脑、冰片、樟脑和水杨酸甲酯等制得，主治风寒湿凝滞筋骨证，常用于治疗类风湿性关节炎［5］，但其成分及作用机制尚不明确。

机体内存在自由基的产生与清除，正常情况下处于动态平衡中。当体内自由基过多时，会使机体产生氧化应激反应，导致炎症反应的产生，因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一［6］。DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）常被用作自由基清除能力评价，其原理是DPPH 从抗氧化剂中吸收一个氢原子，使得其溶液颜色由紫色变为黄色，吸光度降低［7］。

白细胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17 A～F组成的细胞因子亚群，在急性和慢性炎症反应中起着至关重要的作用。IL-17 家族通过其相应的受体发出信号，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在内的下游通路，诱导抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达，共同参与机体炎症及免疫反应进程［8］。

本研究通过超高效液相-线性轨道离子阱-高分辨液质联用技术对伤湿祛痛膏成分进行了解析，并测定了其氧化自由基清除率来表征其抗炎能力，通过分子对接技术［9］探究伤湿祛痛膏对经典炎症信号通路IL-17 家族通路靶点的作用效果，为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn线性离子阱-串联静电场轨道阱高分辨质谱仪，配有：热喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化学工作站（美国Thermo Scientific 公司）；Utimate 3000 UHPLC 超高液相色谱系统，含二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器（美国Thermo Scientific 公司）；UH5300 型双光束紫外可见分光光度计（日本株式会社日立制作所）；MS105DU 型万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料及试剂

伤湿祛痛膏浸膏（哈尔滨力强药业有限公司）；乙酸（质谱级，美国Thermo Scientific 公司）；甲醇（质谱级，美国Thermo Scientific 公司）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；无水乙醇（分析纯，北京化工厂）；双蒸水（香港屈臣氏集团）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS201012-09）。

1.3 超高效液相质谱联用条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.3%乙酸水溶液（A），甲醇溶液（B）；梯度洗脱条件：0～5 min（10%～40%B），5～18 min（40%～60%B），18～30 min（60%～80%B），30～40 min（80%～100%B），40～45 min（100%～100%B）；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2 质谱条件

HESI 电喷雾离子源，正负离子检出模式，电离源电压4 KV，离子源温度350 ℃，气化室温度300 ℃，毛细管电压25 V，镜筒透镜补偿电压110 V，鞘气和辅助气为高纯氮气（纯度＞99.99%），鞘气流速40 arb，辅助气流速20 arb；激活能量单位0.25 q；激活时间30 ms；归一化碰撞能量35%；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～1 300 Da，傅里叶变换全扫分辨率为30 000，二级和三级质谱选取上一级丰度最高的3 个峰进行碰撞诱导解离碎片扫描。

1.3.3 样品制备

取一定量的伤湿祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液，超声30 min，用甲醇稀释至6.25 mg/mL，12 000 rpm 4 ℃离心15 min，取上清液。

1.4 UV-Vis检测DPPH自由基清除

1.4.1 DPPH溶液的制备

精密称取一定量的DPPH，加入一定量的无水乙醇，配制成0.2 mmol/L DPPH母液，现用现配。

1.4.2 供试品溶液的制备

取一定量的伤湿祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液，超声30 min，过滤，用90%甲醇水溶液配制成一定浓度的伤湿祛痛膏溶液，取3 mL 伤湿祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反应30 min，待测。

1.4.3 空白组溶液的制备

取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，避光反应30 min，待测。

1.4.4 对照组溶液的制备

取3 mL 伤湿祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液，避光反应30 min，待测。

1.4.5 反应及测定

将避光反应30 min后的供试品、空白组、对照组溶液移取到1 cm 比色皿中，于517 nm 波长下测定，测定3次取平均值。

1.4.6 专属性考察

取空白组溶液和对照组溶液，在200～900 nm 之间进行全波长扫描，观察对照组溶液在DPPH 的最大吸收波长处是否有吸收。

1.4.7 线性关系考察

精密移取不同体积的伤湿祛痛膏母液，分别置于25 mL 容量瓶中，加入90%甲醇水溶液至刻度线，定容，配制成不同浓度的伤湿祛痛膏溶液。分别取3 mL不同浓度的伤湿祛痛膏溶液，向内加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液，避光反应30 min，在517 nm 波长下测定其吸光度均值，计算自由基清除率，线性拟合。

1.5 分子对接

1.5.1 对接分子的准备

使用Chemdraw19 软件绘制伤湿祛痛膏质谱解析成分，能量最小化处理保存成mol2 格式文件，利用SYBYL X2.1.1 软件进行加氢和加电荷处理，保存成pdb格式。

1.5.2 对接受体的准备

通过KEGG 数据库查询IL-17 家族通路靶点，在PDB数据库［10］获得靶点三维结构，利用SYBYL X2.1.1软件去除水分子及原有配体，加氢、加电荷处理，保存成pdb格式。

1.5.3 柔性分子对接

通过SYBYL X2.1.1 软件，采用Surflex-Dock 柔性对接算法，选择“automatic”自动对接方式，每次对接保留Total-score得分前二十的构象。

2 结果

2.1 伤湿祛痛膏的化学成分鉴定

采用正负离子模式分别进行扫描，通过和已有文献报道比对，鉴定出苍术（CZ）27 种成分、乌头（WT）25 种成分、干姜（GJ）20 种成分、白芷（BZ）4 种成分、当归（DG）4 种成分、八角茴香（BJ）2 种成分、麻黄（MH）2 种成分、山柰（SN）1 种成分，其中多种成分在多味药中均含有，合计鉴别出85 种成分，主要为生物碱、黄酮、香豆素、二苯基庚烷类化合物，结果见图1、表1及表2。

图1 伤湿祛痛膏总离子流图

表1 伤湿祛痛膏正离子模式成分定性分析

续表1

表2 伤湿祛痛膏负离子模式成分定性分析

2.2 UV-Vis检测DPPH自由基清除

专属性考察结果可以看出，伤湿祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波长处没有吸收，对测定没有影响，见图2。因此，选择文献报道［32］的517 nm 作为检测波长，将待测液与DPPH 溶液避光反应30 min 后测定。以DPPH 自由基清除率Y 为纵坐标，伤湿祛痛膏溶液的浓度X（mg/mL）为横坐标进行线性回归，线性考察结果见表3。伤湿祛痛膏溶液在0.1～0.7 mg/mL 浓度范围内与DPPH 自由基清除率呈良好的线性关系，计算得出DPPH 自由基清除率的半数抑制浓度IC50值为0.345 7 mg/mL，说明伤湿祛痛膏具有体外清除DPPH自由基的能力，具有一定抗炎活性。

图2 专属性考察结果

表3 线性关系考察结果

2.3 分子对接

将质谱鉴定出的结构明确的62 个成分与IL-17家族通路的55 个靶点，通过SYBYL X 2.1.1 软件进行分子对接，每次对接显示得分前二十的对接构象，3 410 次对接共产生68 200 个对接构象。根据给出对接打分值Total-score，＞5 分为对接成分与靶点间具有活性，＞7 分为具有很强的活性。使用Origin Lab 将对接结果绘制成热图，结果见图3。结果显示，55 个靶点全部有得分≥5 分的相应对接成分，即伤湿祛痛膏成分对IL-17 家族全部靶点具有对接活性。52 个靶点具有打分值≥7 分的对接成分，占比为94.55%，大部分成分与靶点的对接得分都在7 分以上，并且干姜中的二苯基庚烷类化合物表现出极好的对接活性，与大多数靶点的得分都在10 分以上。说明伤湿祛痛膏对IL-17 家族炎症通路的靶点具有良好的对接活性。将对接打分值前十的对接构象使用Discovery Studio 2020可视化，结果见图4。

图3 对接结果Total-score热图

图4 最佳对接构象结果图

3 讨论

DPPH 自由基清除实验过程中考察了DPPH 的浓度及反应体积，伤湿祛痛膏的浓度、体积及二者的反应时间后，参考文献确定DPPH 的浓度为2 mmol/mL，反应时间为30 min。

LC-MS 实验考察了柱温、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水体系，考虑到峰型和分离度，最终选定了30 ℃柱温、甲醇-0.3%乙酸水为流动相。

类风湿性关节炎终生患病率高达1%，是最常见的全身性炎症关节炎。目前临床用药多是甲氨蝶呤联合糖皮质激素，或者与TNF、B 细胞、T 细胞、白细胞介素的单克隆抗体抑制剂等价格较高的生物制品联用［33-35］。伤湿祛痛膏作为治疗类风湿性关节炎等症的常用药，具有良好的应用前景。本文通过液质联用、自由基清除实验及分子对接方法，阐明了伤湿祛痛膏抗氧化、抗炎作用的药效物质基础。

本实验室前期的网络药理学研究表明，伤湿祛痛膏的组成药味很多，涉及的靶点、通路也较多。本文将关注点放在伤湿祛痛膏成分与经典炎症通路IL-17通路靶点的相互作用。结果显示，伤湿祛痛膏的质谱鉴定成分对此通路涉及的靶点具有很强的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性对接方式，研究表明此算法在几种算法中正确率最高［36-37］。分子对接结果表明，伤湿祛痛膏可以多靶点起到抗炎作用，且具有良好活性，一定程度上解释了伤湿祛痛膏治疗类风湿性关节炎等慢性炎症的科学内涵，为伤湿祛痛膏的后续研究提供一定的参考。