基于代谢组学的不同剂型养心通脉膏对冠心病血瘀证的疗效及机制探讨

钱舒乐，冯宇，周曼丽，俞赟丰，罗晓欣，张家齐，简维雄

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）引起的心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）已成为威胁人类健康的首要因素，且日益向年轻化发展。寻找有效抗AS的策略对于降低CVD 的发病率和病死率具有重要意义。冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病，coronary atherosclerotic heart disease，CHD）即“胸痹心痛”，其主要病机为心脉痹阻，病理变化为本虚标实、虚实夹杂，心血瘀阻证（以下简称血瘀证）是冠心病最常见的证型之一［1］。中医学认为证具有动态演变的特点，本项目组既往研究证实，冠心病心血瘀阻证是一个“血瘀证前期”→“亚血瘀证期”→“心血瘀阻证期”流动的过程［2］。形成初期多为正气亏虚，心失所养，不荣则病；病情持续进展则痰浊内聚，注入血脉，滞塞脉络；日久营血瘀滞，痰瘀互结，沉积血府；最终痹阻心脉，心血瘀阻证形成。

冠心病患者需终身服药，现阶段冠心病的治疗仍以西药为主，但是明显的副作用是患者良好依从性的一个考验。随着中医药事业的发展，中医中药的治疗也逐步进入冠心病的防治中，但中药煎煮方法复杂、汤剂口感不佳等都是临床中面临的问题。中药材已从过去的中草药、动物药和矿物药等，演变发展出超微颗粒剂，剂型的变化使中药兼具疗效和便捷成为可能，但是对于不同剂型的药效众说纷纭。目前对于颗粒剂膏方的研究有限，为数不多的研究尚无法排除不同中药本身所存在的影响因素，故本研究通过观察不同剂型的中药膏方对冠心病血瘀证大鼠的作用，利用客观化的指标，评判不同中药剂型膏方之间的疗效，并对其治疗机制进行探讨。

1 材料

1.1 动物模型

50 只SPF 级雄性SD 健康大鼠［质量合格证编号：SYXK（湘）2019-0009］，体质量（250±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，于湖南中医药大学SPF级动物实验室喂养，在人工调控的环境中饲养（温度：22～26 ℃、湿度：50%～70%），自由饮水和饮食，定期更换垫料，消毒笼具。适应性喂养1 周后用于实验。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

甲醇、甲酸、水、乙腈（CNW 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒创生物科技有限公司）；所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱纯。

1.2.2 仪器

全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP-24/32，上海净信实业发展有限公司）；超声波清洗机（SB-5200DT，宁波新芝生物科技有限公司）；台式高速冷冻离心机（TGL-16 MS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；冷冻浓缩离心干燥器（LNG-T98，太仓市华美生化仪器厂）；高分辨质谱仪（QE plus，赛默飞世尔科技公司）；高效液相色谱仪（Dionex U3000 UHPLC，赛默飞世尔科技公司）；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters）。

2 方法

2.1 动物造模与分组

2.1.1 造模

按照相关文献资料以及本课题组前期研究造模方法［2-6］，分三个阶段复制冠心病心血瘀阻证大鼠模型。

第一阶段：“血瘀证前期”大鼠模型的建立。首先高脂饲养法复制高脂血症大鼠模型。饲料配制：3%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%猪油，81.3%基础饲料。压制成高脂饲料，进行饲喂，第8 天予以维生素D3 溶液灌胃（30 万IU/kg），第15 天时再次用维生素D3 溶液灌胃（30 万IU/kg），第22 天时继续用维生素D3溶液灌胃（20万IU/kg）。

第二阶段：“亚血瘀证期”大鼠模型的建立。将第一阶段成模大鼠持续高脂饲料喂养至第12周。

第三阶段：“心血瘀阻证期”大鼠模型的建立。在第二阶段的基础上，予以皮下多点注射异丙肾上腺素（5 mg/kg），连续1周，记录注射异丙肾上腺素前后大鼠心电图，以心电图J点或ST 段抬高或压低≥0.1 mV 为成模标准。

大鼠饲养期间，饲料均于每天早上一次性给予，24 h 自由饮水；正常对照组（F）大鼠予以普通饲料喂养，其余大鼠造模全过程以高脂饲料喂养。

2.1.2 分组与给药

第三阶段成模后大鼠（造模期间死亡10 只）采用随机数字表随机分4组（每组8只）用于药物干预实验。分别为：蒸馏水干预的模型对照组（G）、颗粒剂养心通脉膏方干预的颗粒膏方组（KL）、传统饮片养心通脉膏方干预的传统膏方组（CT）、养心通脉方汤剂组干预的中药汤剂组（E），实验初预留的大鼠（8 只）作为正常对照组（F）。G 组继续高脂饲料喂养，其余组别普通饲料喂养。每日固定时间灌胃1次，疗程21 d。

中药汤剂组（E）：养心通脉方灌胃（人参、丹参、桂枝、枳实和泽泻等）。中药饮片由广东一方制药有限公司提供，每剂中药分2 次煎煮400 mL 后再浓缩至40 mL。

颗粒膏方组（KL）：颗粒剂养心通脉膏由广东一方制药有限公司提供，将膏剂加蒸馏水配制成与汤剂等浓度药液。

传统膏方组（CT）：传统饮片养心通脉膏由广东一方制药有限公司提供，将膏剂加蒸馏水配制成与汤剂等浓度药液。

模型对照组（G）：按等量蒸馏水灌胃。

正常对照组（F）：普通饲料自由饮食，自由饮水。

根据《实验动物学》中灌胃的参考剂量：大鼠灌胃容积为1 mL/100 g，人与大鼠等效剂量换算为人∶大鼠=1∶6.25。中药则按成人（50 kg）每日每剂服用量400 mL按比例浓缩后灌胃。

2.2 样本采集与处理

第21天灌胃结束后，禁食24 h，称取各组大鼠体质量。异氟烷呼吸麻醉大鼠，进行心电图检测，随后解剖大鼠取下腹主动脉及左心室心肌于冻存管中，置于-80 ℃冰箱待测。

2.3 检测条件

本次实验的分析仪器为Dionex U3000 UHPLC 超高效液相串联QE plus 高分辨质谱仪组成的液质联用系统。

2.3.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：45 ℃；流动相：A 为水（含0.1%甲酸），B 为乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；进样体积：2 μL。洗脱梯度见表1。

表1 洗脱梯度

2.3.2 质谱条件

离子源：ESI；样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。质谱参数见表2。

表2 质谱参数

2.4 生物样品处理方法

实验操作步骤如下：①精确称取30 mg 组织样本到1.5 mL EP 管中，加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入400 μL 甲醇-水（V∶V=4∶1）；②加入2 个小钢珠，在-20 ℃冰箱中预冷2 min 后，放入研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；③冰水浴超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；④离心10 min（13 000 rpm，4 ℃），取300 μL 上清液装入LC-MS 进样小瓶中挥干；⑤用200 μL 甲醇-水（V∶V=1∶4）复溶（涡旋30 s，超声3 min）；⑥-20 ℃下静置2 h；⑦离心10 min（13 000 rpm ，4 ℃），用注射器吸取150 μL 的上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC 进样小瓶，-80 ℃下保存，直到进行LC-MS分析。⑧质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。所有提取试剂使用前均在-20 ℃进行预冷。

2.5 数据处理方法

数据预处理在进行模式识别之前，原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI v2.3 软件（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，其主要参数：precursor tolerance：5 ppm/10 ppm（自建库）；product tolerance：10 ppm/20 ppm（自建库）；product ion threshold∶5%。

对提取到的数据，删除组内缺失值均（0值）＞50%的离子峰，并将0 值以最小值的一半替换，并根据化合物定性结果打分（Score），对定性得到的化合物进行筛选，筛选标准为36 分（满分60 分），36 分以下视为定性结果不准确并删除。

多元统计分析先采用无监督的主成分分析（PCA）观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）来区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

造模期间，大鼠逐渐出现精神倦怠、反应迟钝等情况，成模的血瘀证大鼠毛色偏黄、枯槁无光泽，精神萎靡，活动减少，呼吸稍快，喜蜷缩成团，偶有个别狂躁，部分大鼠肢端爪甲色紫暗。药物干预后，颗粒膏方组、传统膏方组、中药汤剂组大鼠精神逐渐好转，活动量增加，反应能力及进食情况可见恢复趋势，组间未见明显行为差异。正常对照组大鼠始终毛色光泽，反应灵敏，活动及饮食均正常。

3.2 心电图

模型对照组心电图显示J点下移约0.1 mV，提示心肌缺血；颗粒膏方组和传统膏方组心电图基本成窦性心律，J点无明显变化，无明显心肌缺血表现。见图1。

图1 各组心电图

3.3 HE染色

模型对照组的血管内膜结构破坏，内弹性膜崩解断裂，中膜软骨化破坏严重，钙化明显甚至可见空腔结构，内、中、外膜结构不清晰。颗粒膏方组和传统膏方组的主动脉血管内、中、外膜结构基本完整、层次分明，弹性纤维结构清晰。见图2～图4。

图2 模型对照组主动脉HE染色图（从左至右依次为×40，×100，×200，×400）

图3 颗粒膏方组主动脉HE染色图（从左至右依次为×40，×100，×200，×400）

图4 传统膏方组主动脉HE染色图（从左至右依次为×40，×100，×200，×400）

3.4 多元统计分析

3.4.1 QC样本质控

经7-fold crossvalidation（7次循环交叉验证）得到的PCA 模型图，QC 样本等量混合了所有被检测样本，图中QC 样本紧密聚集，表明此实验过程中仪器检测稳定性较好，重复性良好。见图5。

图5 所有样本PCA得分图

对QC 样本的代谢物强度做Boxplot，以对其代谢物强度分布进行评估，其中Y 坐标为质谱强度log10 值，QC 样本的代谢强度集中且稳定，表明本次实验过程质谱系统稳定性较好，实验结果可靠。见图6。

图6 样本代谢物强度箱线图

3.4.2 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘方-判别分析（OPLS-DA）是有监督的判别分析统计方法。该方法在PLS-DA 的基础上进行修正，滤除与分类信息无关的噪音，提高模型的解析能力和有效性，最大化凸显模型内部不同组别之间的差异。在OPLS-DA 得分图上，有两种主成分，即预测主成分和正交主成分。预测主成分只有一个而正交主成分可以有多个。OPLS-DA 将组间差异最大化反映在t1 上，所以从t1 上能直接区分组间变异，而正交主成分上则反映了组内变异。另采用7 次循环交叉验证（7-fold cross validation）和200 次响应排序检验（response permutation testing，RPT）的方法来考察模型的质量，用来衡量模型是否过拟合。

相关模型参数为R2X（cum）=0.657，R2Y（cum）=0.998，Q2=-0.307，模型质量好。结果组间区分明显，即代谢物存在显著差异，提示颗粒膏方对模型大鼠有一定治疗作用。见图7。

图7 颗粒膏方组-模型对照组的OPLS-DA得分图

相关模型参数为R2X（cum）=0.615，R2Y（cum）=0.979，Q2=-0.309，模型质量好。结果组间区分明显，即代谢物存在显著差异，提示传统膏方对模型大鼠有一定治疗作用。见图8。

图8 传统膏方组-模型对照组的OPLS-DA得分图

相关模型参数为R2X（cum）=0.49，R2Y（cum）=0.95，Q2=-0.035，R2Y 和Q2Y 直线的斜率比较接近水平直线，Q2 比较接近于零，因此该模型可能存在过拟合情况。因此虽然图中显示存在组间差异，但不排除模型过拟合导致误差的可能。见图9和图10。

图9 颗粒膏方组－传统膏方组的OPLS-DA得分图

图10 颗粒膏方组－传统膏方组200次响应排序检验

相关模型参数为R2X（cum）=0.637，R2Y（cum）=0.968，Q2=-0.187，模型质量好。结果组间区分明显，即代谢物存在显著差异，提示中药汤剂对模型大鼠有治疗作用。见图11。

图11 中药汤剂组－模型对照组的OPLS－DA得分图

3.5 差异代谢物筛选

采用多维分析和单维分析相结合的办法，筛选组间差异代谢产物。差异代谢物筛选的标准为：OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1，T检验的p-value值＜0.05。经筛选后组间差异代谢物数量见表3。

表3 各比较组差异代谢物数统计

3.5.1 组间差异代谢物详表

组间VIP 值前20 的差异代谢物见表4～表7。其中FC 表示差异倍数，FC＞1 表示组间比较，差异物上调，FC＜1则表示下调。

表4 颗粒膏方组/模型对照组差异代谢物

表5 传统膏方组/模型对照组差异代谢物

表6 颗粒膏方组/传统膏方组差异代谢物

表7 中药汤剂组/模型对照组差异代谢物

3.5.2 火山图

图12～图15中红色圆点代表在实验组中显著上调的差异代谢产物，蓝色圆点代表显著下调的差异代谢产物，灰色点代表不显著的差异代谢产物。

图12 颗粒膏方组-模型对照组的火山图

图13 传统膏方组-模型对照组的火山图

图14 颗粒膏方组－传统膏方组火山图

图15 中药汤剂组－模型对照组的火山图

3.6 代谢通路富集分析

通过对差异代谢物进行通路富集分析，有助于理解在差异样品中代谢途径变化机制。基于KEGG 数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。代谢通路中p-value 为该代谢通路富集的显著性，选择显著性富集pathway 进行气泡图绘制。纵坐标为代谢通路名称；横坐标为富集因子（Rich factor，Rich factor=显著差异代谢物个数/该pathway 中的总代谢物个数），Rich factor 越大，则说明富集程度越大；颜色由绿到红表示p-value 依次降低；点越大，说明富集到该pathway 上的代谢物数目越多。

颗粒膏方组与模型对照组差异代谢物进行通路富集后，发现p-value＜0.05 的通路有16 条。分别为蛋白质消化吸收（Protein digestion and absorption），坏死性凋 亡（Necroptosis），β-丙氨酸代谢（beta-Alanine metabolism），癌症的胆碱代谢（Choline metabolism in cancer），戊糖磷酸途径（pentose-phosphate pathway），血小板活化（Platelet activation），逆行内源性大麻素信号（Retrograde endocannabinoid signaling），氨酰tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis），乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism），味觉传导（Taste transduction），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism），不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），癌症的中心碳代谢（Central carbon metabolism in cancer）和溶酶体（Lysosome）。见图16和表8。

图16 颗粒膏方组－模型对照组气泡图

表8 不同比较组之间富集通路统计列表

颗粒膏方组与模型对照组差异代谢物进行通路富集后，发现p-value＜0.05 的通路有8 条。分别为坏死性凋亡（Necroptosis），卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），蛋白质消化吸收（Protein digestion and absorption），肌动蛋白细胞骨架的调节（Regulation of actin cytoskeleton），神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），GnRH 信号通路（GnRH signaling pathway）和利什曼病（Leishmaniasis）。见图17和表8。

图17 传统膏方组－模型对照组气泡图

颗粒膏方组与模型对照组差异代谢物进行通路富集后，发现有且仅有1 条通路，为嘌呤代谢（Purine metabolism）。见图18和表8。

图18 颗粒膏方组－传统膏方组气泡图

中药汤剂组与模型对照组差异代谢物进行通路富集后，发现p-value＜0.05 的通路有14 条。分别为组氨酸代谢（Histidine metabolism），味觉传导（Taste transduction），ABC transporters，β-丙氨酸代谢（beta-Alanine metabolism），硫代谢（Sulfur metabolism），神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），溶酶体（Lysosome），肌动蛋白细胞骨架的调节（Regulation of actin cytoskeleton），FoxO 信号通路（FoxO signaling pathway），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism），NOD 样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway），尼古丁成瘾（Nicotine addiction）和坏死性凋亡（Necroptosis）。见图19和表8。

图19 中药汤剂组－模型对照组气泡图

4 讨论

秦伯未先生治疗胸痹心痛以“扶养心气、和通血脉”为基本治则［7］，首届国家级中医药教学名师袁肇凯教授宗其理念，调整组方而成的养心通脉方，对CHD心血瘀阻证、高脂血症、高脂血症伴胰岛素抵抗均具有较好的疗效，对于防治冠状微循环障碍和微血栓形成，改善心肌供血，缓解心绞痛有确切作用。在机制学方面研究发现，养心通脉方具备改善心肌缺血、增加冠状动脉血流量、促进血管再生等心肌修复功能［8］。本课题组前期开展的临床研究显示，养心通脉方对冠心病心绞痛缓解的总有效率为91.7%［9］。王东生等的实验研究显示，养心通脉片对动脉粥样硬化模型大鼠具有显著降脂作用［10］。

本研究中，根据心电图以及主动脉HE 染色结果可知，养心通脉方颗粒膏方及传统膏方对冠心病血瘀证模型大鼠均有治疗作用，药物干预后的大鼠心电图及主动脉HE 染色切片结果均有好转趋势，两种剂型的膏方均有显著疗效。经代谢组学分析发现，颗粒膏方组/模型对照组、传统膏方组/模型对照组、中药汤剂组/模型对照组组间差异物共同富集的通路是坏死性凋亡（Necroptosis）；颗粒膏方组/模型对照组、传统膏方组/模型对照组共同富集的代谢通路有蛋白质消化吸收（Protein digestion and absorption），卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）；颗粒膏方组/模型对照组、中药汤剂组/模型对照组共同富集的代谢通路有溶酶体（Lysosome），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），味觉传导（Taste transduction）；传统膏方组/模型对照组、中药汤剂组/模型对照组共同富集的代谢通路有神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），肌动蛋白细胞骨架的调节（Regulation of actin cytoskeleton）。

坏死性凋亡（Necroptosis）结合了坏死和凋亡的特征，受到一系列特有信号通路的密切调节。坏死性凋亡被认为是心脏疾病如血管粥样硬化、缺血再灌注损伤、心肌梗死和心脏重构的重要病理、生理学组成部分［11］。有研究提出，心肌细胞死亡的调控形式在心肌梗死再灌注（缺血/再灌注）中起着重要作用［12］。由实验结果可知，颗粒膏方、传统膏方、中药汤剂在发挥对冠心病血瘀证的治疗作用中，均涉及了坏死性凋亡这一通路，针对坏死信号通路的干预可能为心血管疾病的治疗提供有益帮助。目前已有大量研究发现许多中药复方或提取物能通过调控线粒体、死亡受体或ERS凋亡途径，或调节细胞凋亡途径中的关键因子、通路或靶基因等，发挥显著的心肌或血管保护作用［13］。该通路所含的差异代谢物之一：花生四烯酸，是一种不饱和脂肪酸，也是许多循环二十烷酸衍生物的生物活性物质，如前列腺素E2（PGE2）、前列腺环素（PGI2）、血栓烷素A2（TXA2）和白细胞三烯C4（LTC4）的直接前体。这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用，而以上生物环节与冠心病血瘀证的形成密切相关。HUANG 等的研究显示，发生AMI 的患者中特定花生四烯酸代谢产物的基线水平明显高于对照组［14］。魏星的研究亦发现花生四烯酸是冠心病血瘀证的潜在代谢标志物［15］。同时花生四烯酸还涉及卵巢类固醇生成、不饱和脂肪酸的生物合成两条通路。KL、CT、E 三组的花生四烯酸水平均高于模型对照组，提示经药物干预后，花生四烯酸的代谢水平下降，其含量上升并趋向正常组水平，一定程度上可延缓冠心病的进展。坏死性凋亡通路所涉及的另一差异代谢物是鞘磷脂，这是动物细胞膜及其他各种生物膜的主要组成部分。鞘磷脂的代谢产物如神经酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是具有生物活性的信号分子，可参与细胞增殖与凋亡的调控，由Cer、Sph和S1P共同构成的动态体系，也被称作“鞘磷脂变阻器”（Sphingoliiic Rhecostat）［16］。神经酰胺作为细胞第二信使，在心血管系统可以产生多样的生物学效应：①诱导包括平滑肌及心肌细胞在内的各种细胞凋亡；②调节平滑肌细胞的分化和增殖；③调节免疫功能和炎症反应；④参与氧化应激［17］。研究发现，鞘磷脂类信号通路参与缺血再灌注损伤［17］，极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）等致动脉粥样硬化的脂蛋白都富含鞘磷脂，动脉粥样硬化病变中鞘磷脂的含量高于正常动脉组织，抑制鞘磷脂的从头合成可明显抑制动脉粥样硬化形成［18］。还有证据表明，人体血浆鞘磷脂水平是冠状动脉性心脏病的独立危险因素［19-20］，而且可以预测急性冠状动脉综合征患者的预后［20］。本研究中，KL、CT、E三组的鞘磷脂水平均高于G组，与现有学说不符合，其深层原因需要进一步研究探讨。

在其他的代谢通路中，涉及最多的是氨基酸类差异代谢物。郑景辉等的研究显示，冠心病血瘀证的代谢通路有氨酰tRNA 生物合成、丙酸代谢等［21］。本次研究发现了颗粒膏方和中药汤剂可通过氨酰tRNA 生物合成通路发挥对冠心病血瘀证的治疗作用。该通路涉及的差异代谢物有L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸和L-天冬酰胺。研究表明组氨酸可以作为冠心病血瘀证的潜在生物标志物［22-23］，异亮氨酸也是冠心病血瘀证的潜在代谢标志物［15］。TAO等通过临床研究发现，冠心病经过药物治疗后，其血清的L-赖氨酸含量较治疗前发生显著变化［24］。还有研究发现在冠状动脉发生之前会发生天冬酰胺稳态的改变［25］，对于冠心病有诊断意义。颗粒膏方组、中药汤剂组较模型对照组L-组氨酸水平显著下调，传统膏方组、中药汤剂组较模型对照组L-异亮氨酸下调，颗粒膏方组较模型对照组L-赖氨酸、L-天冬酰胺含量下调，颗粒膏方组、传统膏方组较模型对照组丙酸水平显著下调，提示养心通脉方可能通过调节相关氨基酸代谢含量水平而发挥治疗效果。牛磺酸作为游离氨基酸中的一员，具有较强的抗氧化活性，能通过清除自由基，改善冠心病患者血管内皮的舒张功能，从而减少心肌受损，在冠心病患者中血液含量明显低于正常人［26-27］。也有研究发现高水平的牛磺酸可能对冠心病患者具有保护作用［28］。中药汤剂组牛磺酸含量高于模型对照组，表明养心通脉方可以调节机体牛磺酸含量以治疗冠心病。目前许多研究表明，冠心病患者存在氨基酸代谢异常，本次实验发现养心通脉方治疗冠心病血瘀证涉及的差异氨基酸主要有L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-天冬酰胺、牛磺酸。

冠心病血瘀证形成过程还与心肌细胞能量代谢密切相关。乙酰胆碱（Ach）是一种神经递质，由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶（胆碱乙酰化酶）的催化作用下合成，与三大营养物质的氧化供能反应密切相关。本研究发现其涉及了神经活性配体受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、味觉传导三条通路。引起乙酰胆碱量子性释放的关键因素是神经末梢去极化引起的Ca2+内流。当神经冲动传至神经终板时，膜电位下降，导致可使Ca2+通过的电压闸门通道开放，使Ca2+进入终板，从而刺激终板分泌乙酰胆碱。传统膏方组、中药汤剂组较模型对照组乙酰胆碱含量有下调趋势，养心通脉方可能发挥了类钙离子拮抗剂的作用，抑制了钙离子内流过程，从而导致Ach含量下调。在动物细胞中Ach与受体结合后，一方面直接影响膜对离子的通透性，另一方面通过各种第二信使影响各种生理过程的进行。Ach 可引起许多血管扩张，如肺和冠状血管；但如果血管内皮受损，则Ach的上述作用将不复存在，相反可引起血管收缩。冠心病血瘀证病理状态下，其血管内皮处于损伤状态，此时Ach的缩血管作用对机体不利，为提高冠脉血流量引起的Ach水平下降也可能是养心通脉方的作用机制之一。冠心病血瘀证与肌动蛋白基因及其代谢调控相关［29］，这也可能是Ach含量变化的原因之一。柠檬酸是柠檬酸循环的重要中间代谢物，而柠檬酸循环又是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，也是三大营养素代谢联系的枢纽，更与能量代谢密切相关。二磷酸腺苷（ADP）为三磷酸腺苷（ATP）水解失去一个磷酸根，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物。ADP也存在于血小板细胞内的高密度颗粒内，当血小板发生凝聚反应时被释放，ADP通过血小板上的ADP受体对血小板的形状及生物学行为产生影响，进一步加速血小板的凝聚过程。它是人们发现最早、也是体内最重要的诱导血小板聚集的物质，在体外实验中可观察到其诱导的两种血小板聚集类型。颗粒膏方组、中药汤剂组较模型对照组ADP含量显著上调，这可能是养心通脉方发挥了类ADP 受体拮抗剂的作用，阻止了被释放的ADP与血小板受体结合而减弱血小板的凝聚过程，发挥了“抗血瘀”作用。也可能是冠心病血瘀证本身或者经药物干预后，ATP与ADP转化的平衡发生改变所致。也有研究显示，心肌缺血模型与假手术组的心肌ADP含量无统计学意义，经针刺治疗后其心肌ADP含量与心肌缺血模型组亦无统计学意义［30］。因此ADP含量变化的原因及机制需要进一步深入研究。

中药膏方的应用历史悠久，《黄帝内经》记载有“马膏”“豕膏”。豕膏在当时既作外用亦供内服，而马膏仅供外用。至东汉时期，内服膏剂以“煎”的形式出现，如《金匮要略》中记载有“大乌头煎”［31］，即“大乌头五枚，水三升，取一升，去渣，纳蜜二升，煎令水气尽，强人服七合，弱人服五合；猪膏发煎，膏、乱发，上二味，和膏煎之，发消药成，分再服，并从小便出。”其制备方法与现代膏方的制备方法类似。膏方应用广泛，中医临床应用涉及内、外、妇、儿以及治未病等。范春香等采用加味香砂六君膏方调治脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎，对52 例患者进行服药后临床观察，发现总有效率达到88.46%［32］。周韶谷等采用补肾纳气平喘膏方治疗儿童支气管哮喘，将113 例患者随机分为治疗组（补肾纳气平喘膏方）和对照组（酮替芬），其治疗总有效率分别为91.53%和77.78%［33］。代国方等的研究显示，益气活血中药膏方在干预冠心病冠脉支架植入术后气虚血瘀证患者再狭窄有较好作用［34］。膏方具有补虚和治病两大特点，冠心病（胸痹心痛）中医病机为本虚标实，其疾病特点决定了患者长期服药的必要性。膏方服用方便、口感较好、一人一方的优点可以极大提高患者的服药依从性，克服了传统中药煎煮繁琐、入口苦涩等不便，符合现代人群的医疗需求。本次研究发现颗粒膏方、传统膏方及中药汤剂对冠心病血瘀证均有显著的治疗作用，但是代谢组学分析的通路显示各组药物干预后的具体代谢情况既有交叉的共性部分，也有各自不同的特异部分。相关的特异部分可能与膏方制作的配料以及制作工艺有一定关系，这些变量的影响需要进一步研究。

5 小结

养心通脉方的颗粒膏方、传统膏方与中药汤剂均有针对冠心病血瘀证的治疗作用，其治疗效果无显著差异，其作用机制与坏死性凋亡、氨基酸代谢与能量代谢密切相关，且养心通脉方可能具有类钙离子拮抗剂、类ADP受体拮抗剂的作用。