蔗糖浸种缓解玉米幼苗铜胁迫及其生理指标的灰色关联分析

赵 奇 郭运宏 杨玉珍 陈丽培 罗 青

(1郑州师范学院，生命科学学院，河南 郑州 450052；2郑州铁路职业技术学院，建筑工程系，河南 郑州 450044)

随着城镇工业化的发展，重金属污染带来的环境问题日益突出[1-2]。废弃矿地的开发利用、金属冶炼废液排放、工业污水灌溉、城市的建设、化肥农药的使用等途径均会造成土壤重金属污染[3-6]。铜是一种被广泛关注的重金属污染成分，也是植物必需的微量营养元素，过量会对植物产生毒害从而抑制植物生长[7-9]。部分研究显示蔗糖浸种玉米和小麦能提高其对盐胁迫和干旱胁迫逆境的抗性[10-12]，减轻种子萌发的抑制作用。同时，有研究表明，无胁迫情况下，葡萄糖浸种能提高玉米种子早期发芽率和发芽指数[13]。糖对活性氧代谢及其响应基因的表达亦有重要的调控作用[14]。有关外源糖作为信号分子，对植物萌发过程影响的研究已有较多报道[15-17]。有关蔗糖对植物影响的研究多集中在盐分胁迫、水分胁迫以及低温等抗逆性研究方面，而蔗糖缓解植物重金属胁迫的报道较少。因此，本研究采用蔗糖浸种处理玉米，探究玉米幼苗在铜胁迫下的生理特性，旨在探明铜胁迫对玉米的毒害作用，进一步了解蔗糖浸种对玉米铜胁迫的缓解作用，为农作物抗重金属污染研究提供思路，也为重金属污染治理提供可借鉴的数据。同时，在此基础上，进行蔗糖浸种玉米重金属抗性与各生理生化指标的灰色关联分析，量化各因素与抗性的主次关系，优化筛选可用的生理指标，亦对玉米抗性育种具有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用玉米(Zea maysL．)品种为郑单958，购于河南秋乐种业科技股份有限公司。蔗糖浸种和铜胁迫试验所用蔗糖和硫酸铜(分析纯)试剂均购于郑州万田生物公司。

1.2 试验设计

本试验采用两因素试验设计。根据前期预试验及相关的研究结果[10]，蔗糖浸种处理质量浓度为342．3 mg.L-1，设置4 个硫酸铜浓度水平，分别为0、100、200、400 mg.L-1，试验设3 次重复。首先用10%次氯酸钠浸泡玉米种子10 min，再用蒸馏水冲洗5～6 次，采用342．3 mg.L-1(1 mmol.L-1)蔗糖浸种，并以蒸馏水浸种作为对照，放置暗处25℃至萌动，之后放置RQX-400H智能型人工气候箱(常州金坛精达仪器制造有限公司)中培养，光照时间为12 h，昼温25℃，夜温18℃。选取株高3 cm 左右整齐一致的幼苗，每天上午8：00 和下午16：00 定时加入硫酸铜处理液2 次，每次18 mL。处理12 d 后，取样测定株高、根长、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD) 活 性、 过 氧 化 物 酶(peroxidase，POD)活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性。

1.3 测试指标与方法

1．3．1 玉米生长状况指标测定 处理12 d 后，取玉米幼苗，测量记录株高、根长等指标，并计算相对根长、相对株高。相对根长＝蔗糖浸种根长/对照根长，相对株高＝蔗糖浸种株高/对照株高。

1．3．2 生理指标测定 叶绿素含量采用乙醇浸提分光光度法测定[18]；SOD 活性采用氮蓝四唑还原法测定[19]；POD 活性采用愈创木酚法测定[20]；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[21]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[22]；CAT 活性采用紫外吸收法测定[21]；脯氨酸含量采用茚三酮法测定[22]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 25．0 统计软件进行数据处理、绘图和相关性分析。

采用灰色关联分析方法进行多因素关联程度的定量化比较分析[23-25]，参照王士强等[26]和胡江龙等[27]的研究，重金属抗性系数＝Xd/XCK，其中Xd为胁迫下指标测定值，XCK为对照组指标测定值。将重金属抗性系数和所测全部生理生化指标作为一个灰色系统，依据具体生理指标与抗性的关系，以每个指标所对应的最优值构成的数列作为参考数列X0，胁迫生理生化指标作为比较数列Xi(i＝1，2，3……)，参照公式(1)进行参考数列和比较数列的无量纲化处理，参照公式(2)和(3)完成关联系数和关联度的计算：

式中，X′i(k)为原始数据无量纲化结果，Xi(k)为指标值，X为平均值，Si为标准差。

式中，ξoi(k)是第k个参考数据列与比较数据列的关联系数，表示为Χ0序列与Χi序列在k 点的绝对差，为Χ0序列与Χi序列的最小差值，为Χ0序列与Χi序列的最大差值。δ为灰数白化值，δ∈(0，1)，一般取0．5，本研究取值0．5。

式中，n为关联系数的数量。

2 结果与分析

2.1 蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗生长的影响

由图1 可知，不同浓度铜胁迫下，蔗糖浸种均能提高玉米幼苗的株高。在0、100、200、400 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组的株高相比蒸馏水浸种分别增加了11．39%、32．48%、32．37%、19．35%。在100、200、400 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组的相对株高相比蒸馏水浸种组分别增加18．92%、19．67%、7．14%。两因素方差分析结果显示，蔗糖浸种对玉米株高和相对株高的影响极显著(F＝379．31∗∗，F＝36．57∗∗)；铜胁迫对玉米株高和相对株高的影响均达到了极显著水平(F＝955．55∗∗，F＝394．01∗∗)；蔗糖浸种与铜胁迫互作对玉米株高和相对株高的影响达极显著水平(F＝20．45∗∗，F＝8．04∗∗)。综上可知，铜胁迫抑制了玉米幼苗地上部的生长，试验使用的蔗糖浸种浓度能极显著减轻铜胁迫对玉米幼苗生长的抑制作用。

由图2 可知，蔗糖浸种提高了铜胁迫下玉米幼苗的根长。在0、100、200、400 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组的根长分别较蒸馏水浸种组增加了3．74%、18．46%、11．76%、24．32%。100～400 mg.L-1硫酸铜水平，蔗糖浸种组的相对根长与相同铜胁迫下蒸馏水浸种组相比增幅为13．11%、6．25%、20．00%，其中以400 mg.L-1硫酸铜水平时增幅最高。铜胁迫浓度为100、400 mg.L-1时，蔗糖浸种组玉米幼苗根长与蒸馏水浸种组相比差异极显著(P＜0．01)。两因素方差分析表明，蔗糖浸种对玉米根长和相对根长的影响达到极显著水平(F＝48．87∗∗，F＝14．73∗∗)；蔗糖浸种与铜胁迫互作对根长和相对根长的影响不显著。

综上，铜胁迫对玉米幼苗根部的抑制作用明显高于地上部，且蔗糖浸种能有效缓解铜胁迫对玉米幼苗地上部和地下部的生长抑制作用，有利于玉米的正常生长

图1 蔗糖浸种对硫酸铜处理下玉米幼苗株高的影响Fig.1 Effect of seed soaking with sucrose on plant height of maize treated with copper sulfate

图2 蔗糖浸种对硫酸铜处理下玉米幼苗根长的影响Fig.2 Effect of seed soaking with sucrose on root length of maize treated with copper sulfate

2.2 蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗叶绿素含量的影响

玉米幼苗叶绿素含量变化如图3 所示，蔗糖浸种后，玉米幼苗叶绿素含量变化无明显规律， 除200 mg.L-1铜胁迫，其他铜胁迫处理玉米幼苗叶绿素含量较蒸馏水浸种均略提高。随着硫酸铜浓度升高，蔗糖浸种组叶绿素先升后降，其中100 mg.L-1铜胁迫处理的叶绿素含量最高方差分析结果表明，蔗糖浸种对玉米幼苗叶绿素含量无显著影响(F＝0．51)。

2.3 蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影响

图3 蔗糖浸种对硫酸铜处理下玉米幼苗叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of seed soaking with sucrose on chlorophyll content of maize treated with copper sulfate

由图4-A 可知，蔗糖浸种提高了铜胁迫下玉米幼苗的SOD 活性。在0、100 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组SOD 活性分别较蒸馏水浸种组提高1．86%和4．43%；在200、400 mg.L-1硫酸铜水平下，SOD 活性提升幅度高达28．04%和21．53%，且差异达极显著水平(P＜0．01)，因此，硫酸铜浓度高于100 mg.L-1时，蔗糖浸种能极显著提高SOD 活性。两因素方差分析表明，蔗糖浸种及其与铜胁迫互作对玉米幼苗SOD 活性均达极显著影响(F＝306．95∗∗、F＝76．70∗∗)。

由图4-B 可知，与蒸馏水浸种相比，蔗糖浸种后玉米幼苗POD 活性升高，在100 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种POD 活性提升幅度最大(14．06%)，随着铜胁迫浓度继续增加，提升幅度有所降低，硫酸铜浓度为400 mg.L-1时增幅降至4．73%。100～400 mg.L-1硫酸铜水平范围内，除400 mg.L-1硫酸铜水平下蔗糖浸种组POD 活性显著高于蒸馏水浸种组外(P＜0．05)，其他浓度铜胁迫时，蔗糖浸种组POD 活性均极显著高于蒸馏水浸种组(P＜0．01)，表明蔗糖浸种能显著提高铜胁迫处理玉米幼苗的POD 活性。且两因素方差分析表明，蔗糖浸种与铜胁迫互作对玉米幼苗POD 活性具有极显著影响(F＝5．62∗∗)。

由图4-C 可知，与蒸馏水浸种相比，蔗糖浸种处理后，除200 mg.L-1硫酸铜水平外，玉米幼苗CAT 活性均有所提高。蔗糖浸种后玉米幼苗响应铜胁迫的CAT 增幅变化较为复杂，增幅由高到低对应的铜胁迫浓度依次为100、400、0 mg.L-1。两因素方差分析表明，蔗糖浸种以及蔗糖浸种与铜胁迫互作均对CAT 活性有极显著影响(F＝85．46∗∗和F＝29．5∗∗)。

综上可知，与蒸馏水浸种相比，除200 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组CAT 活性略微下降外，蔗糖浸种处理均提高了玉米幼苗的SOD、POD、CAT 活性，表明蔗糖浸种提升了玉米幼苗抗氧化酶活性，在一定程度上减缓了铜胁迫伤害。

图4 蔗糖浸种对硫酸铜处理下玉米幼苗SOD、POD、CAT 活性的影响Fig.4 Effect of seed soaking with sucrose on SOD、POD、CAT of maize treated with copper sulfate

2.4 蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗渗透调节物质的影响

由图5 可知，与蒸馏水浸种相比，蔗糖浸种后玉米幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量变化较复杂，无明显一致性，仅在100 mg.L-1硫酸铜水平下，3个指标均提高，分别为14．89%、10．74%、19．23%，脯氨酸含量的提升幅度高于其他2 个指标。蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的影响均未达到显著水平(F值分别为0．48、0．005 和0．07)。综上，蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗渗透调节物质无显著影响，而铜胁迫极显著增高了玉米幼苗渗透调节物质(P＜0．01)。

2.5 灰色关联度的分析结果

图5 蔗糖浸种对硫酸铜处理下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的影响Fig.5 Effect of seed soaking with sucrose on soluble sugar、soluble protein and proline of maize treated with copper sulfate

依据灰色系统理论，将蔗糖处理对铜胁迫恢复指数与其他生理生化指标作为一个灰色系统，蔗糖处理对铜胁迫恢复指数做参考序列，生理生化指标作为比较序列，计算比较序列与参考序列的关联度，关联度数值越高，比较系列与参考系列的变化态势越接近，表明该指标与蔗糖浸种处理对玉米幼苗铜胁迫恢复能力关系越密切。通过计算求出各指标与抗逆系数的关联度并进行排序，结果如表1 所示。各生理指标与蔗糖浸种处理对铜胁迫恢复指数的灰色关联度从大到小依次为：相对根长、相对株高、根长、脯氨酸含量、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性、叶绿素含量、SOD 活性、株高。

在11 个指标中，相对根长为根部相关指标，与蔗糖处理对铜胁迫恢复指数关系最为密切(0．799)，此外，根长指标排名第三(0．767)，根部相关指标排位较靠前。地上部指标中，相对株高位居比较序列第二(0．775)，但株高关联度排序靠后(0．579)。在显著性差异分析中表明，蔗糖处理组与对照处理组间株高有极显著差异(P＜0．01)，而株高指标与胁迫恢复指数间的关联度却较低，说明直接用株高来检测蔗糖处理对铜胁迫缓解能力不太合适，选择相对株高更准确，这为蔗糖浸种缓解玉米铜胁迫的抗逆研究中指标的选用提供了重要参考。

表1 各指标与恢复指数的灰色灰色关联度及关联序Table 1 Grey correlation degree and rank of trains and recovery index

3 讨论

重金属对农作物种子萌发和生长发育的影响是研究者关注的焦点[28]，较多学者在提高植物重金属胁迫的耐受性和抗逆性的研究中，使用多效唑[29]、甜菜碱[30]、硫元素[31]、拮抗金属离子[32]等多种处理方法，而有关蔗糖浸种缓解重金属胁迫的相关报道较少。本研究采用蔗糖浸种方式，进行铜胁迫下的玉米萌发生理研究，发现玉米幼苗的萌发形态学指标、生理生化指标等发生了一定的变化。研究结果表明，玉米幼苗在铜胁迫下对地下部生长的抑制作用高于地上部，这与前人的研究结果一致[28]；且蔗糖浸种处理能有效缓解重金属铜对玉米幼苗的生长抑制，这与赵莹等[10]有关外源糖可以缓解玉米盐逆境时的生长抑制研究结果类似。本试验结果表明，外源蔗糖对铜胁迫玉米的萌发有重要影响，但其是否具有类似植物激素信号分子性质，以及如何调控玉米生长发育和响应铜胁迫尚需进一步研究。

大量研究表明，重金属胁迫下植物抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性的表现不尽相同，徐成斌等[33]研究铬胁迫玉米种子萌发时，发现SOD 活性、POD 活性、MDA 含量随处理浓度的升高而升高。陈顺钰等[34]关于铅镉重金属的研究结果表明，SOD、POD 和CAT 活性变化趋势不完全一致，随着处理浓度的增加，SOD活性降低，POD 和CAT 活性则呈先升高后降低再升高的趋势。本研究中铜胁迫下SOD 活性逐步升高，POD和CAT 活性则先升后降，这与前人的成果不完全一致[35-38]，推测可能与不同物种抗氧化酶体系对重金属响应差异以及不同生育时期、胁迫程度不同等有关。本研究中，与蒸馏水浸种相比，在一定浓度的铜胁迫下，蔗糖浸种能显著提高玉米幼苗的抗氧化酶活性，推测可能是蔗糖通过影响还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和磷酸戊糖代谢途径调控了活性氧水平[10]。后续可开展磷酸戊糖代谢途径的限速酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢基因调控谷胱甘肽含量等方面的研究，探明蔗糖提高铜胁迫下玉米幼苗抗氧化酶能力的作用机制。

此外，逆境胁迫下生物细胞膜会受到一定程度的损伤，生物体可通过积累有机物质调节细胞渗透势来减缓伤害[39-40]。本研究通过测定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的结果表明，铜胁迫对玉米幼苗3 个指标均有显著的影响(F值分别为97．41∗∗、6．93∗∗、112．30∗∗)，体现了植物自身对逆境的抵抗，这与前人的研究结果类似[27，29]。而本研究中，仅在100 mg.L-1硫酸铜水平下，蔗糖浸种组3 个渗透调节物质的含量升高。蔗糖处理对铜胁迫下3 个指标含量无显著影响，而铜胁迫处理对3 个渗透调节物质含量均有显著影响，表明植物对铜胁迫有较明显的抵抗响应。因此，蔗糖浸种处理与植物自身对重金属的抵抗响应作用相比影响微弱，引起差异的作用机制尚需进一步研究证实。

逆境抗性生理指标的优化筛选是抗性生理研究的一项内容[41-42]。本研究与多品种的抗性聚类划分、主成分分析归类，研究的出发点不同，不宜进行横向优劣比较。本研究借助灰色系统理论进行蔗糖缓解玉米幼苗铜胁迫的能力与生理指标关联程度的研究，结果表明，优选指标建议重点考虑相对根长、相对株高、根长、脯氨酸含量、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性等中高关联指标。从生理学角度考虑，以上亦是植物缓解铜胁迫的重要抗逆指标，例外的是SOD 活性指标关联度较低，需要进一步从关联度、变异系数以及胁迫浓度范围与抗性生理指标间的稳定性方面深入分析原因。

4 结论

通过蔗糖浸种对铜胁迫下玉米幼苗的生理研究发现，本试验所用浓度为342．3 mg.L-1的蔗糖浸种能有效缓解400 mg.L-1以下铜胁迫对玉米幼苗生长的抑制作用，有效提高抗氧化酶活性；能提高200 mg.L-1以下硫酸铜处理的渗透调节物质，但整体影响效果不显著。蔗糖浸种缓解玉米幼苗铜胁迫的优选指标可重点考虑相对根长、相对株高、根长、脯氨酸、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性等。本研究为玉米重金属抗性研究提供了理论数据，为揭示蔗糖缓解植物重金属胁迫的分子机制提供了参考，同时为抗逆指标筛选方面提供了借鉴。但本研究设置的蔗糖浸种浓度尚需进一步细化，蔗糖浸种缓解玉米幼苗铜胁迫的生化代谢途径及分子作用机理方面仍需要深入研究。