银杏叶渣制肥对小白菜种子萌发及幼苗生长的影响

邵金华 全沁果 张文兵 熊佳萱 文天凤 杨川川

(1湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州 425199；2湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425199；3湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425199；4 土传病害绿色防控湖南省工程研究中心，湖南 永州 425199)

过渡使用化肥会破坏土壤原有的结构和生境，使得蔬菜的养分吸收和运输发生障碍，导致其产量和品质随之下降[1]，且化肥中的重金属元素、硝酸盐、放射性物质易污染蔬菜，造成食品安全隐患[2]。生物有机肥是以有机固体残留物为原料，包括有机垃圾、农副产品废弃物、动物粪便等，经过微生物发酵、去味及腐熟后制得的一类有机肥料[3]。该肥料包含多种植物生长所需的营养元素，并能改善土壤理化性状及施用化肥造成的土壤板结，增强土壤的保水、供肥、保肥能力[4]。因此，生物有机肥作为化肥的替代品在蔬菜生产中具有广泛的应用前景。

银杏叶作为中药材，由银杏(Ginkgo bilobaL．)的叶片干燥制得，有效成分主要包括银杏黄酮醇苷、银杏萜内酯、银杏多糖[5]。其黄酮与萜内酯化合物对高血脂症、冠心病和心绞痛等中老年心血管疾病疗效显著[6]。在生产该中成药过程中会产生大量银杏叶残渣，大部分被直接丢弃，且缺乏回收利用技术，造成了环境污染与资源浪费。本试验以银杏叶残渣为原料，采用单因素-正交试验优化 EM ( effective microorganisms)菌种发酵制备生物有机肥的工艺条件，分析肥料的品质，并探究以该肥料为配方的水浸液对小白菜种子萌发及幼苗生长的影响，以期为银杏叶渣的二次开发以及价值提升提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

银杏叶渣为工业提取黄酮和内酯后得到的残渣，由湖南恒伟药业提供，将其烘干后粉碎，密封保存。EM 菌种来源于中国普通微生物管理中心；EM 培养基为南京宏远生物科技有限公司生产；小白菜种子购自湖南省永州市种子管理站。

试验地位于湖南科技学院实验园区(26°12′43．31"N，111°35′48．71"E)，海拔122．45 m，处于温、热带线合部，属热带季风气候，气候温和，雨量充沛，土地肥沃，年降水量1 290 ～1 900 mm，年均日照1 873．7 h，年均无霜期285 ～311 d，年均气温17．6 ～18．6℃。土壤有机质含量14．36 g.kg-1、全氮含量0．84 g.kg-1、硝态氮含量573．26 mg.kg-1、铵态氮含量10．64 mg.kg-1、全磷含量0．42 g.kg-1、速效磷含量15．03 mg.kg-1、全钾含量16．99 g.kg-1、速效钾含量60．37 mg.kg-1。试验前风干、磨细、过40 目筛备用。

1.2 试验设计

1．2．1 EM 菌种的活化 用超纯水将EM 培养基稀释10 倍，将其以50 mL/瓶均匀分装至250 mL 锥形瓶中，于立式压力蒸汽灭菌器筒中进行灭菌处理，于室温自然冷却至40℃以下备用。在超净工作台下用接种环挑取适量EM 菌接种至50 mL 经灭菌的EM培养基中，将锥形瓶口用棉花和报纸包扎紧且混匀后，于37℃恒温培养箱中以200 r.min-1振荡培养3 d。培养结束后，于4℃、10 000 r.min-1离心5 min，以无菌生理盐水充分洗涤后制成约1010CFU.mL-1的菌悬液备用。

1．2．2 制肥工艺的单因素试验 称取一定量的银杏叶渣，置于250 mL 锥形瓶中，依次加入无菌水、葡萄糖，调节pH 值为7．20。放进高压灭菌锅中进行灭菌处理，待其自然冷却至室温后接入1．2．1 中制得的EM菌悬液1．00 mL，然后在37℃条件下进行恒温发酵，以腐殖酸含量作为衡量发酵程度的指标。固定初始条件为发酵时间2 d、液料比1 mL.g-1、银杏叶渣添加量10．00 g、葡萄糖添加量0．50 g，研究发酵时间(2、4、6、8、10 d)、液料比(1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 mL.g-1)、银杏叶渣添加量(10、15、20、25、30 g)、葡萄糖添加量(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 g)的变化对腐殖酸含量的影响。根据公式计算腐殖酸含量[7]：

式中，A1表示空白组消耗的硫酸亚铁铵标准滴定溶液体积，mL；A2表示样品消耗的硫酸亚铁铵标准滴定溶液的体积，mL；C 表示硫酸亚铁铵标准滴定溶液的体积，mol.L-1；K 表示纯腐殖酸中碳的系数，参考泥炭腐殖酸约为0．51；M 为样品质量，g；A0为风干样品的含水量，%。

1．2．3 制肥工艺的正交试验 在单因素试验的基础上，以发酵时间、液料比、银杏叶渣添加量、葡萄糖添加量设置4 因素3 水平正交试验，根据腐殖酸的含量确定银杏叶渣制肥的最适发酵参数。随后对最适发酵参数进行试验验证。正交试验的因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test

1.3 测定项目与方法

1．3．1 生物有机肥的相关成分测定 银杏叶渣制肥相关成分的测定按《NY 884-2012 生物有机肥》[8]执行，测定其有效活菌数和有机质含量，以及砷、镉、铅、铬、汞5 种重金属含量。

1．3．2 种子发芽率的测定 将银杏叶渣制肥和去离子水制成水浸液等份放入3 个培养皿中，设置0．1、0．2、0．4、0．8、1．6 g.mL-15 个浓度梯度，以去离子水为对照(CK)，将小白菜种子分别于不同浓度水浸液中浸泡8 h 后统一取出。每个发芽床上各放置50 粒种子，然后用镊子将小白菜种子的腹沟朝下，再将其整齐的排列在发芽床上，以避免相互之间接触，防止发霉的种子感染健康种子。之后盖上培养皿盖，将其置于28±1℃恒温光照条件下培养3 d。发芽期间每天观察发芽情况以及发芽床的湿润情况，并及时补充缺失的水分，以胚根达到或超过种子长度、胚芽达到种子长度1/2判定为发芽，测定根长，根据公式计算种子发芽指数[9]：

1．3．3 幼苗生长测定 设置0．1、0．2、0．4、0．8 g.mL-14 个浓度梯度的银杏叶渣肥制水浸液，以去离子水为对照(CK)，将其加至瓶底铺有2 张滤纸的圆柱玻璃瓶中，选取5 颗萌发程度相当的种子放入瓶内，定时补充水浸液，5 d 后分别测定小白菜幼苗的苗长和根长。平行试验3 次。

1．3．4 根系酶活测定 将1．3．3 中水培5 d 后的小白菜幼苗从培养瓶中取出，转移过程中注意保护其根部，将根部用超纯水洗净后用吸水纸吸干，加入相应体积提取液，于冰水浴环境下制成组织匀浆。根系脱氢酶活性的测定采用TTC 法[10]，硝酸还原酶活性的测定采用α-萘胺法[11]。

1．3．5 品质指标的测定 取适量1．3．4 中采集的小白菜幼苗，洗净后于70℃电热鼓风干燥箱中干燥至恒重备用。可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[12]，游离脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法[13]。

1．3．6 盆栽出苗率及生物量的测定 设置生物有机肥添加量10%为底肥(T1)、氮肥-生物有机肥复合处理为底肥(N 施入量为100 mg.kg-1，生物有机肥添加量为5%，T2)，以不施肥的土壤(CK1)和以氮肥为底肥(N 施入量为200 mg.kg-1，以NH4H2PO4和尿素的形式加入，CK2)的土壤作为对照。每盆装培养土2 kg，均匀播种50 粒小白菜种子，重复3 次。播种后洒水至土壤湿润，之后视土壤状况适时补水。1 周后计算出苗率并间苗，每盆留长势均匀的小白菜幼苗15 株。20 d 后取样，将小白菜根部用超纯水洗净后用吸水纸吸干，测定小白菜生物量(包括根鲜重、茎叶鲜重和总鲜重)。

1.4 数据分析

各试验组均平行3 次，取其平均值。利用Origin 2018 作图，并用SPSS 19．0 采用Duncan 法进行差异显著性检验(P＜0．05)。

2 结果与分析

2.1 银杏叶渣制肥的单因素试验

由图1-A 可知，初期腐殖酸含量随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间达到6 d 后其含量开始降低。银杏叶废渣中的无机盐和营养物质随着发酵的进行不断被释放，6 d 后已趋于饱和，继续延长发酵时间腐殖酸会逐渐被代谢分解。因此确定发酵时间6 d 附近为正交试验研究区间。

由图1-B 可知，随着液料比的增加，样品中的腐殖酸含量呈先升后降的趋势。当液料比过小时，样品发酵产生的腐殖酸溶出不充分。而当液料比大于2．0 mL.g-1后，腐殖酸的溶出达到饱和，其在水相中的溶解量也会增加，使得样品的实测值有一定降低。因此确定液料比2．0 mL.g-1附近为正交试验研究区间。

由图1-C 可知，样品中腐殖酸的含量随着银杏叶渣用量的增加先升高后降低。当银杏叶渣用量超过25 g 后，体系中的发酵菌种数量和营养不足以支持发酵底物的增加，实测腐殖酸的含量随之降低。故确定银杏叶渣用量25 g 附近为正交试验研究区间。

由图1-D 可知，葡萄糖用量对样品中腐殖酸的含量影响较大。随着葡萄糖用量的增加，样品中的腐殖酸含量迅速提升，当葡萄糖添加量超过1．5 g 后，腐殖酸的含量开始下降。这可能是由于添加过多的葡萄糖以后，其在水中的溶解度达到了饱和，影响了银杏叶渣中其他有机成分的溶出，进而减少了腐殖酸的生成。

图1 发酵时间(A)、液料比(B)、银杏叶渣用量(C)和葡萄糖用量(D)对腐殖酸含量的影响Fig.1 Effects of fermentation time(A), solid-liquid ratio(B), addition amount of residue of Ginkgo biloba L.(C) and addition amount of glucose(D) on contents of humic acids

2.2 银杏叶渣制肥的正交试验

正交试验和方差分析结果如表2 所示。通过极差分析发现，各因素对腐殖酸含量影响大小的排序为：葡萄糖用量(D)＞银杏叶渣用量(C)＞发酵时间(A)＞液料比(B)，液料比与方差分析的结果一致；且银杏叶渣用量(C)和葡萄糖用量(D)对试验影响显著(P＜0．05)。进一步比较均值筛选出最优水平为A2B3C2D2，即发酵时间6 d、液料比2．5 mL.g-1、银杏叶渣用量25 g、葡萄糖用量1．5 g。在该条件下进行验证试验，平行3 次，测定腐殖酸平均含量为39．36%。将配方统一换算为百分数表示，即银杏叶渣添加比例26．95%、去离子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%。

2.3 银杏叶渣肥的相关成分的测定

由表3 可知，与《NY 884-2012 生物有机肥》[8]相比，以银杏叶渣为基质通过微生物发酵所制有机肥样品的有效活菌数和有机质含量指标明显优越，且砷、镉、铅、铬和汞均处于安全限量标准内，表明该有机肥样品具有良好的应用前景。

表2 发酵工艺优化正交试验直观分析表Table 2 Visual analysis table of orthogonal experiment for fermentation process optimization

表3 有机肥的相关成分(以干基计)Table 3 Related components of organic fertilizer (dry basis)

2.4 银杏叶渣制肥对小白菜种子萌发的影响

由图2 可知，银杏叶渣有机肥浓度的改变对小白菜种子发芽指数有显著影响。在一定范围内随其浓度的增加，小白菜种子发芽指数逐渐升高，当浓度超过0．4 g.mL-1后，发芽指数开始下降，浓度超过0．8 g.mL-1后下降幅度明显增加。综合来看，该银杏叶渣生物有机肥使用量在0．1 ～0．8 g.mL-1范围内具有显著的促生潜力。

2.5 银杏叶渣制肥对小白菜幼苗生长的影响

根长和苗长(地上部高)是体现植物初期生长状态的直观指标，反映当前生境对植物生长的适宜性。由图3 可知，与CK 相比，随着银杏叶渣有机肥浓度(0～0．4 g.mL-1)的提升，小白菜幼苗的根长和苗长显著提高。当浓度达到0．4 g.mL-1时，根长和苗长分别增加约39．25%和68．50%。继续提高肥料浓度时，根长和苗长变化不显著。可见，制得的生物有机肥对小白菜幼苗的根系扩散和植株生长具有明显的正向促进作用。

根系脱氢酶和硝酸还原酶是对植物生长发挥关键调控作用的酶类[14]。由图4 可知，与CK 相比，银杏叶渣生物有机肥明显提高了小白菜幼苗的根系脱氢酶和硝酸还原酶活性。当水浸液中有机肥浓度为0．4 g.mL-1时，小白菜幼苗的根系脱氢酶和硝酸还原酶活性分别较CK 提升约33．48%和27．84%，继续提高有机肥浓度则对两种酶的活性影响不大。可见，银杏叶渣制肥对植物生长有关的主要酶类具有正向调控作用。

图2 不同处理水平对小白菜种子发芽指数的影响Fig.2 Effects of different treatment levels on germination index from seeds of Brassica chinensis L.

图3 不同处理水平对小白菜幼苗根长和苗长的影响Fig.3 Effects of different treatment levels on root and seedling length from seedlings of Brassica chinensis L.

脯氨酸和可溶性糖是植物生长过程中重要的渗透调节物质，其累积量与植物的抗逆性呈相关[15]。黄酮类化合物和有机酸是植物中重要的次生代谢产物，也是对人体健康有益的活性成分，其含量与蔬菜品质密切相关[16-17]。由图5 可知，银杏叶渣制肥对小白菜幼苗中脯氨酸、可溶性糖、总黄酮和可滴定酸的积累均有促进作用。当有机肥浓度为0．4 g.mL-1时，小白菜幼苗中脯氨酸、可溶性糖、总黄酮和可滴定酸含量比CK，分别显著提升约47．95%、213．10%、42．93%和69．75%，继续增加有机肥浓度则对其含量影响不显著。

图4 不同处理水平对根系脱氢酶和硝酸还原酶活性的影响Fig.4 Effects of different treatment levels on activities of root dehydrogenase and nitrate reductase

2.6 银杏叶渣制肥对小白菜出苗率及幼苗生物量的影响

由表4 可知，施用不同底肥对盆栽小白菜的出苗率和生物量有较大影响。T1(以生物有机肥为底肥)的平均出苗率和生物量显著高于CK1(空白土壤)和CK2(以氮肥为底肥)，平均出苗率分别提高14．00 和6．66 个百分点，茎叶鲜重和根鲜重依次分别提升85．86%、43．76%(CK1、CK2)和71．43%、20．00%。相比T2(以生物有机-氮复合肥为底肥)，T1的平均出苗率和根鲜重无显著差异，但茎叶鲜重显著提高11．13%，总鲜重显著提高10．77%。表明银杏叶渣生物有机肥对小白菜的促生作用明显，且优于传统氮肥。

3 讨论

利用农业废弃物发酵制备生物有机肥是实现其综合利用的有效途径之一。相关研究表明，以豆粕、杜仲叶、菠萝叶等为原料所制备生物有机肥对蔬菜具有明显的促生效果[18-21]，而银杏叶渣中富含氮、磷、钾等多种微量元素，可将其作为制备优质有机肥的原料[22]。基于此，本研究以腐殖酸含量为评价指标，采用正交试验优化EM 菌种发酵银杏叶渣制备生物有机肥的工艺参数，确定该有机肥最适固态发酵工艺为：银杏叶渣添加比例26．95%、去离子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%、发酵时间6 d。肥效验证结果表明，采用最适固态发酵工艺制备得到的银杏叶渣生物有机肥可有效提高小白菜种子的发芽指数，促进小白菜幼苗根系和植株的发育，其主要品质指标符合《NY 884-2012 生物有机肥》标准[8]。

图5 不同处理水平对脯氨酸、可溶性糖、总黄酮和可滴定酸含量的影响Fig.5 Effects of different treatment levels on contents of proline, soluble sugar, total flavonoids and titratable acid

表4 不同底肥对小白菜出苗率及幼苗生物量的影响Table 4 Effect of different base fertilizers on the emergence rate and biomass of Brassica chinensis L.

植物种子萌发过程中，胚乳中所含的蛋白质、淀粉等发生水解生成氨基酸、单糖等小分子化合物，然后再经过合成作用构建植物体[23]。范倩等[24]使用由混合菌剂腐熟紫茎泽兰所制备的有机肥(EDA)处理小麦种子，使种子发芽率、苗高、发芽指数及活力指数均得到有效提高，并观察到EDA 对小麦种子胚乳中的蛋白质、淀粉和六磷酸肌醇等大分子物质水解表现出明显的促进作用。本试验中，有机肥处理组小白菜幼苗体内的脯氨酸、可溶性糖含量均显著高于CK，推测该有机肥也是通过加速种子胚乳中大分子物质的水解，增强构建植物体所需基础物质的供应，从而提高了小白菜种子的发芽指数和幼苗生长速率。

此外，根系中所含的多种呼吸酶对植物的生长也具有关键调控作用，酶的活性与植物体内物质转换、能量代谢等过程密切相关[25-26]。研究发现根系脱氢酶的活性可直接影响植株地上部的营养累积状况，而硝酸还原酶活性是反映植株对生境中NO-3-N 同化速率的直观指标[27]，参与了植物氮素代谢通路中催化硝酸盐还原成亚硝酸盐的反应[28]。本试验中，随着银杏叶渣生物有机肥浓度的增加，受试小白菜幼苗的根系脱氢酶、硝酸还原酶活性和总黄酮、可滴定酸含量均呈升高趋势，与上述研究相互补充、相互验证。推测是因为微生物在发酵银杏叶渣的过程中生成的腐植酸等促生因子，促使相关酶的活性发生改变，最终影响植物养分吸收、营养积累等过程。

综上所述，本研究发现银杏叶渣生物有机肥的水浸液对小白菜种子萌发及幼苗生长具有显著的促进作用，小白菜幼苗根系脱氢酶和硝酸还原酶得到激活，幼苗体内总黄酮、可滴定酸含量提高，改善了小白菜的发育水平和品质。本研究为回收利用制药工业产生的银杏叶残渣提供了新思路，但有关该肥料对食用农产品促生作用的田间试验以及工业化制肥还有待进一步研究。

4 结论

本研究采用正交试验方法确定了银杏叶渣制备有机肥的最佳工艺为：银杏叶渣添加比例26．95%、去离子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%、EM菌发酵时间为6 d，该条件下肥料的腐殖酸含量为39．27%，有效活菌数、有机质和重金属含量指标符合《NY 884-2012 生物有机肥》标准。所制银杏叶渣生物有机肥使用量在0．1 ～0．8 g.mL-1范围内具有显著的促生潜力，其水浸液显著提高了小白菜种子的发芽指数，促进了小白菜幼苗根系和植株的发育；小白菜幼苗根际脱氢酶和硝酸还原酶得到激活，幼苗体内总黄酮、可滴定酸含量提高，改善了小白菜的发育水平和品质。