外周血FGF2、VEGFA及循环肿瘤细胞含量水平与肺癌转移的相关性

韩媛媛 魏玉磊 章春芝

肺癌是起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤，也称为支气管肺癌。吸烟、大气污染、遗传是引发肺癌的重要因素［1⁃2］。近年来肺癌的发病率增长较快，对人们的健康和生命安全造成严重威胁。肺癌患者病情进展快，肺癌远处转移是导致患者死亡的主要原因［3］。肺癌的转移可以通过多种途径，而淋巴转移是最主要的途径。外周血成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是特异性的淋巴管内皮细胞标志物，有研究认为其与淋巴转移密切相关［4］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是由于肿瘤病灶发生脱落从而进入外周血中的各类肿瘤细胞的统称，具有转移的潜能［5］。本研究通过分析外周血FGF2、VEGFA 及CTC 含量水平与肺癌转移的相关性，为临床诊疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月至2020年3月在本院进行手术治疗的74 例肺癌患者，其中男46 例，女28 例；平均（60.28±5.43）岁；鳞癌25 例，腺癌19 例，小细胞肺癌17 例，腺鳞癌4 例，肺泡细胞癌4 例，大细胞癌3 例，癌肉瘤2 例。

纳入标准：①经手术病理学证实为原发性肺癌；②资料完整；③入组之前未行手术治疗、放化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②临床分期或转移情况不能确定者；③依从性差。本研究经过本院医学伦理委员会批准，受试者签署研究知情同意书。

1.2 检测方法

外周血FGF2、VEGFA 检测方法：采用免疫组化法检测FGF2、VEGFA 在癌组织及癌旁组织中的表达水平，FGF2 鼠抗人多克隆抗体购自艾美捷科技有限公司，VEGFA 兔抗人多克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自上海闳巨生物科技有限公司。

选用真空血管，采集肘正中静脉血8 mL，加入EDTA 抗凝。②肿瘤细胞富集：采用免疫磁珠富集肿瘤细胞，将富集的肿瘤细胞均匀涂抹在载玻片上，常温风干，用4%的多聚甲醛固定5 min，PBS 溶液清洗3 次，每次3 min，常温干燥，置于-70℃冰箱保存干燥。③免疫细胞化学染色（Envision法）：取出切片，PBS 洗三次，加入细胞角蛋白抗体，放置于4℃的冰箱过夜，之后用PBS 清洗三次，加入二抗（Envision），置于37℃恒温箱中20 min，PBS 洗三次，DAB 溶液显色，再用苏木素复染3 min，酸酒精分化、脱水，采用透明、中性树胶进行封片。

1.3 阳性标准

FGF2、VEGFA 阳性标准［6］：根据每张切片的着色按照棕褐色、棕黄色、淡黄色、无着色计为3～0分。按照着色面积，无着色、＜1/3，1/3～2/3，＞2/3 计分0～3 分，两项总分之和大于3 分即为阳性。

CTC 阳性标准：光镜观察细胞呈长形、圆形或椭圆形，长径大于10 μm，有完整的细胞形态，细胞质呈蓝黑色或褐色，核浆比失常。国际目前无标准的CTC 阳性判定标准，本研究以见到CTC 即为阳性。

1.4 观察指标

①比较肺癌组织与癌旁组织中外周血FGF2、VEGFA 及CTC 含量水平。②分析癌组织中FGF2、VEGFA 及CTC 表达水平与病理特征的相关性分析，病理特征包括淋巴结转移、组织学类型、肿瘤大小、PTMN 分期、分化程度、年龄。③绘制ROC 曲线，评估FGF2、VEGFA 及CTC 表达水平对肺癌患者淋巴结转移的预测价值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料以%表示，行χ2检验，采用ROC 曲线评估癌组织FGF2、VEGFA 及CTC 表达水平与肺癌患者淋巴结转移的相关性，P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGFA、CTC 以及FGF2 免疫组化染色结果

VEGFA、CTC 以及FGF2 免疫组化染色阳性结果。见图1。

图1 VEGFA、CTC 以及FGF2 免疫组化染色结果（×100）Figure 1 Immunocytochemical staining results ofVEGFA，CTC and FGF2（×100）

2.2 肺癌患者癌组织与癌旁组织的FGF2、VEGFA 及CTC 表达情况

肺癌患者癌组织的FGF2、VEGFA 及CTC 表达阳性率均高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 肺癌患者癌组织与癌旁组织的FGF2、VEGFA 及CTC 表达情况［n（%）］Table 1 Expression of FGF2，VEGFA and CTC in cancer tissues and adjacent tissues of patients with lung cancer［n（%）］

2.3 癌组织FGF2、VEGFA 及CTC 表达与肺癌患者临床病理特征的关系

癌组织FGF2、VEGFA 及CTC 阳性表达与组织学类型、肿瘤大小、分化程度、年龄无关（P＞0.05），与淋巴结是否转移、PTMN 分期有关（P＜0.05）。见表2。

表2 癌组织FGF2、VEGFA 及CTC 表达与肺癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Table 2 The relationship between the expression of FGF2，VEGFA and CTC and clinicopathological characteristics of lung cancer patients［n（%）］

2.4 癌组织FGF2、VEGFA 及CTC 表达水平对淋巴结转移的预测价值

联合检测的AUC 为0.889（0.807～0.971，P<0.000），诊断指数最大（敏感性90.39%，特异性91.25%，准确度92.44%）。见表3和图2。

3 讨论

肺癌是全球肿瘤发病率和死亡率最高的癌种，肺癌主要分为非小细胞肺癌（Non small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），非小细胞肺癌约占肺癌的85%［7］。肺癌的常见治疗方法为手术治疗、放化疗等，近年来医学技术不断进步，然而肺癌患者的5年生存率并没有显著改善，肺癌的转移是造成患者病情复发及死亡的主要原因［8］。肺癌转移的途径有局部浸润、淋巴道转移、血行转移，其中以淋巴道转移最为常见［9］。肺癌转移是一个复杂的生物学过程，研究肿瘤的转移与发展过程，对患者病情的治疗与预后具有重要价值。

本研究结果提示FGF2、VEGFA 及CTC 阳性表达均可作为肺癌转移的标志物。分析可能的原因是肿瘤细胞需要得到血液的供应，新生血管的生成是必不可少的条件，VEGFA 具有分泌功能，对刺激血管的生产具有调控作用，恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因［10］。FGF2 与肝素结合具有广泛的促有丝分裂和血管生成活性，这种蛋白与多种生物学过程有关，如肢体和神经系统发育、伤口愈合和肿瘤生长［11］。CTC 能逃避机体免疫，在原发或远处脏器驻留，从而形成复发、转移病灶。CTC 是病灶转移的关键部分，对转移肿瘤患者进行预后评估是目前CTC 临床应用最广泛的领域，恶性肿瘤患者治疗前后的CTC 类型和数目的变化具有重要的预后提示价值［12］。赵伟等［13］研究认为FGF2、VEGFA 参与恶性肿瘤侵袭与转移过程，VEGFA 可刺激血管内皮细胞的增殖，在恶性肿瘤中含量更高，FGF2 在多种肿瘤组织及体液中均能检测出，对肿瘤具有促进作用，与本研究结果提示FGF2、VEGFA 及CTC 可能参与肿瘤的发生、发展过程。吕福有等［14］研究认为VEGFA 可促进淋巴管内皮细胞的增殖，促使淋巴结转移。本文研究结果显示FGF2、VEGFA 及CTC 联合检测的AUC 为0.889，诊断指数最大（敏感性90.39%，特异性91.25%，准确度92.44%）。FGF2 能够提升肿瘤细胞的侵袭能力，使得肿瘤细胞迁移活动增强，增加淋巴结转移的可能性。VEGFA 促进肿瘤细胞的增殖，也可增加新生淋巴，增加淋巴转移的风险。CTC 是远处转移的前提，有研究认为CTC 在肺癌的复发与转移中起到重要作用，可作为检测病情进展的重要指标［15］。Ippokratis 等［16］研究发现在小细胞肺癌一个化疗周期后CTC 检出率明显降低，在疾病进展期CTC 检出率和数量明显增加，研究认为CTCs 的增加和PD 患者非凋亡CTCs 的增加可能是OS 降低的独立预后因素。三个指标联合检测可提高临床评估肺癌患者淋巴结转移的准确性，有助于医生评估病情的进展，及时采取治疗措施，延长患者的生存期。

综上所述，FGF2、VEGFA 及CTC 在肺癌患者的肿瘤组织中阳性表达水平较高，参与肿瘤的侵袭与转移过程，对临床治疗与预后评估具有重要的指导价值。本研究存在一些不足之处，研究选取的病例较少，需要后续增加样本量，进一步探讨FGF2、VEGFA 及CTC 与临床病理特征及预后的预测价值。