外周血miR⁃21⁃5p表达对多囊卵巢综合征不孕患者人工授精结局的预测价值

张丽 李友云 王永超 邢素娟 赵慧玲

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性常见的内分泌疾病，以雄激素增多、胰岛素抵抗、排卵障碍为特征，是目前临床上无排卵性不孕的主要原因。人工授精（intra⁃uterine insemination，IUI）是治疗不孕症的有效手段，操作相对简单、成本低廉且治疗过程接近自然受孕过程，对于反复诱导排卵仍未能妊娠的PCOS患者可选择IUI［1⁃2］。但是，目前IUI 治疗PCOS 不孕的临床妊娠率较低，影响PCOS 不孕患者IUI 妊娠结局的因素复杂、机制也不十分明确［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是近些年生殖医学领域受到越来越多关注的一类非编码小分子RNA，能够在转录后水平调节多种基因的表达，进而实现对卵巢功能、子宫内膜容受性的调控［4］。国内李红娟关于PCOS 的动物实验发现，miR⁃21⁃5p 在PCOS 大鼠中表达减少且过表达miR⁃21⁃5p 对卵巢颗粒细胞的增殖具有促进作用、凋亡具有抑制作用［5］，但miR⁃21⁃5p 在PCOS 不孕中的作用及其与妊娠结局的关系尚不清楚。因此，本研究将分析外周血miR⁃21⁃5p 表达的变化及其对IUI 结局的预测价值。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2017年1月至2019年12月期间在本院接受IUI 的178 例PCOS 不孕患者作为PCOS 组，纳入标准：①符合PCOS 诊断标准［6］；②未避孕性生活1年以上的不孕者；③女方输卵管造影及B 超证实至少1 侧输卵管通畅；④男方精液常规符合IUI 标准。排除标准：①生殖系统畸形或其他疾病导致的不孕；②因多卵泡发育或无优势卵泡发育而取消周期的患者；③IUI 过程中精液液化异常、处理后精子密度＜2×106/mL、A+B 级精子回收率＜20%；④合并恶性肿瘤、糖尿病等。另取同期体检的102 例月经周期正常且已婚已育女性作为对照组。PCOS 组年龄26～36 岁、平均（32.74±7.82）岁，BMI（24.37±7.82）kg/m2；对照组年龄25～37 岁、平均年龄（33.12±8.51）岁，BMI（23.51±9.29）kg/m2。两组间一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者均知情，本实验通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 外周血miR⁃21⁃5p 表达的检测

取两组受试者的空腹外周静脉血3 mL，采用北京天根公司生产的试剂盒进行检测。首先，采用miRNA 提取试剂盒分离提取外周血中的总miRNA，而后用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒将miRNA 反转录为对应的cDNA，最后miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒进行PCR 检测，分别使用目的基因miR⁃21⁃5p 及内参基因U6 的特异性引物，按照下列程序进行反应：95℃预变性3 min 后95℃15 s、60℃34 s 循环40 次，得到反应的循环曲线及循环阈值（Ct），以U6 为内参、按照公式2⁃ΔΔCt计算miR⁃21⁃5p 的表达水平。

1.2.2 IUI 方法

首先在月经第3～5 d 时进行促排卵治疗，方案包括克罗米芬、（HMG）、克罗米芬联合HMG；监测优势卵泡，当直径达14 mm 后每日监测尿LH，出现LH 峰当日或优势卵泡直径达18 mm 后，使用重组人绒毛膜促性腺激素（hCG）250 μg，24～36 h 后进行IUI。IUI 后进行黄体支持，给予黄体酮胶囊100 mg 口服2 次/日，连续服用14 d。

1.2.3 临床资料的收集

查阅PCOS 组患者的病历并收集以下临床资料：年龄、BMI、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、抗苗勒氏管激素（AMH）、高雄激素血症、促排卵方案、优势卵泡数目。

1.2.4 IUI 结局的判断

IUI 后14 d 查血及尿hCG 以确定是否生化妊娠；35 d 后行阴道B 超检查，见到宫内孕囊、胚芽、心管搏动确定为临床妊娠。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件统计分析，计量资料用（）表示，两组间的比较采用t检验，计数资料用n（%）表示，用χ2检验，miR⁃21⁃5p 对IUI 结局的预测价值采用ROC 曲线分析，IUI 结局的影响因素采用logistic 回归分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血miR⁃21⁃5p 表达的比较

与对照组（0.93±0.22）比较，PCOS 组(0.59±0.18)患者外周血miR⁃21⁃5p 的表达水平明显降低，差异有统计学意义（t=13.470，P＜0.05）。

2.2 PCOS 组中临床妊娠患者与未临床妊娠患者外周血miR⁃21⁃5p 表达的比较

与PCOS 组中临床妊娠患者（0.41±0.13）比较，未临床妊娠患者（0.63±0.17）外周血miR⁃21⁃5p 的表达水平明显降低，差异有统计学意义（t=6.497，P＜0.05）。

2.3 miR⁃21⁃5p 预测PCOS 组患者临床妊娠的ROC 曲线分析

绘制miR⁃21⁃5p 预测PCOS 组患者IUI 后临床妊娠的ROC 曲线，曲线下面积为0.852（95%CI：0.785 4～0.919 1，P＜0.001），根据约登指数最大值确定最佳截断值为0.522，该截断值预测临床妊娠的灵敏度为85.71%、特异性为76.00%。见图1。

图1 miR⁃21⁃5p 预测PCOS 组患者临床妊娠的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of miR⁃21⁃5p in predicting clinical pregnancy in PCOS group

2.4 PCOS 组中临床妊娠患者与未临床妊娠患者临床资料的比较

PCOS 组中临床妊娠患者与未临床妊娠患者比较，年龄、BMI、FSH、LH、促排卵方案的差异无统计学意义（P＞0.05），高雄激素血症、AMH、优势卵泡数目的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 PCOS 组中临床妊娠患者与未临床妊娠患者临床资料的比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between patients with clinical pregnancy and patients without clinical pregnancy in PCOS group［n（%），（±s）］

表1 PCOS 组中临床妊娠患者与未临床妊娠患者临床资料的比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between patients with clinical pregnancy and patients without clinical pregnancy in PCOS group［n（%），（±s）］

临床资料年龄（岁）BMI（kg/m2）FSH（U/L）LH（U/L）AMH（ng/mL）高雄激素血症优势卵泡数≥2 个临床妊娠患者（n=28）32.04±7.56 23.94±5.67 6.51±1.24 8.74±1.21 10.92±2.81 2（7.14%）22未临床妊娠患者（n=150）32.98±7.92 24.55±7.93 6.84±1.05 8.48±1.46 8.37±2.14 38（25.33%）74 t/χ2值0.580 0.389 1.482 0.886 5.492 4.481 8.119 P 值0.562 0.698 0.140 0.377 0.000 0.034 0.004

2.5 PCOS 组患者妊娠结局影响因素的logistic 回归分析

以PCOS 组患者妊娠结局作为应变量，以妊娠患者与未临床妊娠患者比较的单因素分析中有统计学差异的因素作为自变量，进行logistic 回归分析可知：miR⁃21⁃5p、AMH、优势卵泡数目是PCOS组患者妊娠结局的影响因素。见表2。

表2 PCOS 组患者妊娠结局影响因素的logistic 回归分析Table 2 Logistic regression analysis of influencing factors of pregnancy outcome in PCOS group

3 讨论

IUI 是治疗不孕症常用的辅助手段，通过导管将优化后的精液注入宫腔，操作简单、损伤小且治疗过程接近自然受孕过程，易于被患者接受。PCOS 是不孕的常见病因之一，对于反复诱导排卵仍未能妊娠的PCOS 患者，IUI 是一线治疗方案。但是，IUI 治疗PCOS 不孕的妊娠率较低，影响妊娠结局的因素十分复杂，相关的分子机制也未完全阐明。

卵巢储备功能反映了女性生育潜能，具体是指卵巢内存留卵泡的数量及其发育为优质卵泡的能力。AMH 由窦卵泡合成并分泌，是反映卵巢储备功能的理想指标，在PCOS 发病过程中窦卵泡数量增加、AMH 分泌也异常增多［7］。根据国内谢言信［8］的研究，AMH 对PCOS 不孕患者IUI 治疗的周期取消、妊娠结局均具有预测价值，预测周期取消的ROC 曲线下面积达0.731、而预测妊娠结局的ROC 曲线下面积仅0.585，提示虽然卵巢储备功能评价指标AMH 对PCOS 不孕患者IUI 结局具有预测价值，但预测效能较弱、ROC 曲线下面积较小。因此，需要寻找对PCOS 不孕患者IUI 结局具有更强预测效能的指标。

颗粒细胞是卵巢中重要的功能细胞，PCOS 发病过程中颗粒细胞的过度凋亡会使卵泡发育停滞在次级卵泡阶段，进而出现卵巢多囊改变［9⁃10］。miRNA 是颗粒细胞增殖及凋亡重要的上游调控分子［11⁃12］，李红娟［5］的研究中显示在PCOS 大鼠卵巢中miR⁃21⁃5p 的表达减少，过表达miR⁃21⁃5p 能够抑制卵巢颗粒细胞凋亡。本研究结果表明miR⁃21⁃5p 表达减少与PCOS 不孕的发生有关，可能机制是miR⁃21⁃5p 低表达促进了颗粒细胞凋亡、影响卵泡发育及卵巢储备功能。

PCOS 不孕患者IUI 治疗后妊娠结局的影响因素复杂，国内多项相关的研究表明AMH、优势卵泡数目及多项精子指标均是PCOS 不孕患者IUI结局的影响因素［13⁃16］。本研究在入组时排除了可能影响IUI 结局的男性精子因素，对miR⁃21⁃5p 及其他临床因素对IUI 结局的影响进行了logistic 回归分析，结果显示：miR⁃21⁃5p、AMH、优势卵泡数目是PCOS 不孕患者妊娠结局的影响因素。其中miR⁃21⁃5p 与PCOS 不孕患者妊娠结局相关的结果与miR⁃21⁃5p 抑制颗粒细胞凋亡的生物学作用吻合，也与本研究已经发现的PCOS 不孕患者IUI 治疗后未临床妊娠患者miR⁃21⁃5p 表达减少的结果一致；AMH、优势卵泡数目与PCOS 不孕患者妊娠结局相关的结果与国内已有的相关研究结果一致。

综上所述，PCOS 不孕患者外周血miR⁃21⁃5p表达减少且对IUI 结局具有预测价值，未来miR⁃21⁃5p 有可能成为研究PCOS 不孕分子机制的靶点。