基于TCGA数据库分析PFKFB4在肝细胞癌的临床意义及分子机制

段怡平 陈梁玥 柳家翠 黄奔 程庆元 马甜甜 朱翠雯 秦菲

肝癌为常见的恶性肿瘤，以肝细胞癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）为主，肝癌病例数的增长最为迅速，且5年总体生存率（overall sur⁃vival，OS）仅为18%。对于早期肝癌患者，手术切除仍是最主要的治疗方法［1⁃2］，然而多数患者难以早期发现，且术后5年复发率高，预后较差［3］。因此，寻找新型有效的分子靶标，对改善LIHC 的预后具有重要意义。6⁃磷酸果糖⁃2⁃激酶/果糖⁃2，6⁃二磷酸酶4（6⁃phosphofructo⁃2⁃kinase⁃fructose⁃2，6⁃bisphosphatase 4，PFKFB4），其编码的蛋白质可合成果糖2，6⁃二磷酸酯（Fructose⁃2，6⁃diphosphate，F26BP），刺激糖酵解［4］。PFKFB4在多种肿瘤过表达，以满足癌细胞的生物需求。PFKFB4参与各种生物学过程，包括细胞周期、自噬和转录调控［5］，且提示抑制PFKFB4表达可能是有效的癌症治疗策略［6］。近年来，有研究证实PFKFB4与乳腺癌［7］、小细胞肺癌［8］、膀胱癌［9］、胃癌［10］进展密切相关，使患者预后较差。然而，PFKFB4在LIHC 发挥的作用和分子机理仍未阐明。本研究通过分析TCGA 数据库探讨PFKFB4在LIHC 患者中的预后价值，并预测其可能的分子机制，为LIHC 提供新的分子靶标。

1 资料与方法

1.1 数据的下载与预处理

在癌症基因组图谱（The Cancer Genome At⁃las，TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）检索并下载LIHC 的RNA 表达数据（HTSeq⁃FP⁃KM，level 3）包括374 例肿瘤样本和50 例正常样本及424 例临床数据。利用软件Strawberry Perl 5.30.1 将基因表达数据整理成基因表达矩阵用于后续分析，并删除临床特征不明确和生存时间缺失的患者数据。

1.2 PFKFB4 表达与临床病理特征和预后相关性分析

使用R 4.0.2 软件提取PFKFB4在LIHC 组织样本和正常组织样本中的mRNA 表达量数据并分析比较两组的表达水平差异，根据PFKFB4在LIHC 中的表达量中位值将患者分为高表达和低表达组。通过IBM SPSS Statistics 25.0 软件利用卡方检验分析PFKFB4表达与临床病理特征之间的相关性。利用R 4.0.2 软件通过Kaplan⁃Meier 法分析两组之间OS 的差异，使用单因素和多因素Cox回归分析PFKFB4在LIHC 的预后价值。

利 用MEXPRESS 在线数据库（https：//mex⁃press.be/）分析PFKFB4基因与临床病理特征的联系。同时，通过GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/）、OncoLnc 数据库（http：//www.oncolnc.org/）和Kaplan Meier⁃plotter 数据库（https：//kmplot.com/analysis/）验证PFKFB4的生存分析结果。

1.3 基因富集分析

利用GSEA 4.1.0 软件以Molecular Signature Database（MsigDB）数据库中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集作为功能基因集对PFKFB4进行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设1 000 次，其他参数均设为默认值。

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO（本体论）富集分析，根据P⁃value 从小到大选取前十个富集通路作图。

1.4 DNA 甲基化分析

通过MethSurv 在线数据库（https：//biit.cs.ut.ee/methsurv/）对PFKFB4甲基化位点在LIHC 患者中的分布情况进行分析，同时，利用UALCAN 在线数据库分析PFKFB4在LIHC 患者肿瘤组织和正常组织中的DNA 甲基化水平差异，再通过TCGA Wanderer 数据库（http：//maplab.imppc.org/wanderer/）分析PFKFB4相关甲基化位点。

1.5 统计学分析

采用软件SPSS 25.0 进行数据分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验、Wilcoxon 秩和检验，将LIHC 患者的年龄、性别、TNM 分期等临床指标进行量化赋值，利用Cox 比例风险回归模型进行单因素和多因素分析，生存分析采用KM 法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFKFB4 在LIHC 组织中的表达

TCGA⁃LIHC 数据集分析显示，PFKFB4在LIHC 样本中的表达量高于正常样本，差异有统计学意义（P<0.05）（图1A⁃B）。UALCAN 数据库分析结果也显示，PFKFB4在LIHC 组织中表达显著上调（P<0.05）（图1C）。

图1 PFKFB4 在LIHC 组织和正常组织的差异表达Figure 1 Differential expression of PFKFB4 in LIHC tissues and normal tissues

2.2 PFKFB4 表达与临床病理特征相关性分析

PFKFB4表达水平与TNM 分期（P<0.05）和T分期显著相关（P＜0.05）（表1）。Stage 分期Ⅱ、Ⅲ期的PFKFB4表达水平显著高于Ⅰ期，差异有统计学意义（P<0.05），而Stage 分期Ⅳ期由于样本数太少，故结果存在偏倚（图2A）；T 分期的T2、T3、T4 期患者的PFKFB4表达水平均显著高于T1 期患者的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2B）。MEXPRESS 分析结果显示，PFKFB4的表达量与LIHC 患者的Stage 分期、样本类型及患者OS 呈显著负相关（P<0.05）（图2C）。

2.3 PFKFB4 表达与LIHC 患者预后的关系

单因素和多因素Cox 回归分析结果表明，PFKFB4（HR=1.91，95%CI：1.48～2.97，P<0.05）可以作为LIHC 患者的独立预后因素（表2）。在TCGA⁃LIHC 数据集中，在LIHC 患者中，PFKFB4高表达提示不良预后，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A）。Kaplan Meier⁃plotter（HR=2.10，95%CI：1.33～2.73，LogrankP＜0.05）、GEPIA（HR=1.6，P＜0.05）和OncoLnc 在线数据库分析结果均显示PFKFB4高表达与较差的OS 有关（图3B⁃D）。

表1 PFKFB4 表达与LIHC 患者临床病理特征的相关性分析［n（%）］Table 1 Relationship between PFKFB4 expression and clinicopathological characteristics of patients［n（%）］

图2 PFKFB4表达量与LIHC患者临床病理特征相关性分析Figure 2 Correlation analysis between PFKFB4 expression and clinicopathological features of LIHC

表2 单因素和多因素Cox 回归分析Table 2 Univariate and multivariate cox regression analysis of PFKFB4 in LIHC

图3 PFKFB4 表达在LIHC 中的预后分析Figure 3 Prognostic analysis of PFKFB4 expression in LIHC

2.4 GSEA 功能富集分析

在KEGG 数据集中，通过GSEA 分析预测，PFKFB4可能参与了DNA 复制、同源重组、碱基和核酸切除修复、细胞周期、RNA 降解和P53 信号通路（图4A）。String 数据库确定与PFKEB4相关性最强的50 个基因，利用GO 分析发现PFKFB4在糖酵解、细胞自噬和P53 介导的生物学过程（BP）中可能发挥重要作用（图4B）。

2.5 PFKFB4 基因甲基化分析

PFKFB4的甲基化位点 cg16986746 和cg08568670 是LIHC 患者中甲基化水平最低和最高的两个位点（图5A），UALCAN 数据库分析结果显示其在LIHC 样本中的整体甲基化水平比正常样本低，并与PFKFB4的表达量呈显著负相关（P＜0.05）（图5B）。TCGA Wanderer 分析结果发现PFKFB4与LIHC 发生发展相关的甲基化位点有6个，分别是cg04498104、cg25845890、cg01364498、cg14564247、cg12259140、cg17226356，均维持低甲基化修饰水平（P<0.05）（图5C）。

3 讨论

PFKFB4属于双功能酶家族，可动态调节6⁃磷酸果糖和F26P 的水平，而F26P 是糖酵解途径的关键酶磷酸果糖激酶1 的变构激活剂［11］。PFKFB4控制着成年细胞的糖酵解速率，且在PI3K⁃AKT 信号通路中发挥重要作用［12］。p53 可下调PFKFB4的表达，而PFKFB4的耗尽会减弱p53 缺陷细胞的合成活性，沉默PFKFB4可诱导体内p53 缺陷癌细胞凋亡［6］。PFKFB4通过激活致癌类固醇受体共激活因子3 调节转录细胞重编程［7］，是癌症快速增殖和转移的标志［13］。PFKFB4在多种肿瘤中过表达，可促进癌细胞代谢及增殖，导致癌症的恶化［10，14］。

增强的肿瘤糖酵解作用（Warburg 效应）为促进癌细胞的增殖和转移提供了代谢基础，PFKFB4高表达的乳腺癌患者预后很差，被证实是乳腺癌的独立预后因子［15］。PFKFB4可抑制抑癌基因的表达，保证胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可作为胃癌潜在的分子靶标［16］。PFKFB4在前列腺的小细胞癌组织中过表达，促进葡萄糖降解，与肿瘤的侵袭性相关，可能是重要的分子靶标［17］。通过分析黑素瘤细胞系对低氧条件的反应，对高表达和低表达PFKFB4的患者分别进行Kaplan⁃Meier 生存分析，PFKFB4高表达会导致黑色素瘤患者的预后不良［18］。癌症的标志之一是DNA 甲基化异常，这与基因表达异常有关。转移性基因的低甲基化和激活是癌细胞的特征［19］，癌基因的低甲基化水平可激活癌基因高表达，促进肿瘤的发生发展，提示患者的不良预后。但仍未有研究探讨PFKFB4在LIHC 的预后价值以及分子机制。

本研究通过分析结果提示着LIHC 的恶性进展。生存分析结果显示，PFKFB4上调的患者OS较差。Cox 回归分析表明PFKFB4可作为LIHC 的独立预后因子。同时，功能富集分析发现PFKFB4可能参与了一些癌症相关通路，为进一步探索其在LIHC 发生发展中的分子机制提供了基础。

PFKFB4能促进小细胞肺癌（Small Cell Lung Carcinoma，SCLC）的化学耐药且与不良预后相关，可作为SCLC 潜在的治疗靶点及化疗反应的预测因素［8］。膀胱癌标本中的PFKFB4高表达，可导致肿瘤细胞代谢异常，阻断PFKFB4的表达可能成为膀胱癌有效的治疗策略，这为探索膀胱癌的治疗方法提供了新的研究方向［9］。Hu 等人［20］证实PFKFB4是胰腺癌中蛋白酶体抑制剂的潜在生物标志物，且可用于监测治疗反应。因此，可通过检测PFKFB4表达量和甲基化水平，以判断是否满足使用分子抑制剂的条件，从而有效治疗LIHC 患者。

综上所述，PFKFB4在LIHC 中异常上调，其过表达和低甲基化水平也提示着患者较差的总体生存期及肿瘤的恶性发展，且主要参与糖酵解和P53等信号通路的调控。PFKFB4是LIHC 治疗潜在的新型分子靶标。