一株采油枯草芽孢杆菌发酵条件优化

王慧冬，修建龙，黄立信，俞理，马原栋

(1.中国科学院大学，北京 100049；2.中国科学院渗流流体力学研究所，河北 廊坊 065007； 3.中国石油勘探开发研究院，北京 100083)

油藏经过一次采油和二次采油后，只能收集40%左右[1]。因此3次采油技术备受关注[2]。常见三采方法有：热力驱、化学驱、混相驱和微生物强化采油[3]，其中微生物采油越来越受到重视。枯草芽孢杆菌是一种微生物驱油中常用的菌种[4]，发酵时可以产生大量脂肽类生物表面活性剂[5-6]，具有独特的两亲性分子结构，可以在油水两相界面定向排列，形成分子层，降低表面张力、改变岩石表面的润湿性、与原油形成乳状液，有利于提高原油采收率[7-9]，油田现场油藏注气困难且气体利用率低，导致好氧菌种生长缓慢，因此内源发酵效果较差，而地面增殖发酵后,将发酵液直接注入油井是一个很好的解决方法[10]，但是发酵营养剂用量大，发酵成本高。本文通过培养基中NH4Cl部分代替NaNO3，既降低了成本，同时可以保证脂肽产量，在微生物驱油工艺中有很好的应用潜力。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

供试菌株BacillussubtilisSL-2，为中科院渗流流体力学研究所三次采油重点实验室微生物渗流实验室菌种库所保存菌种;蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米浆干粉、酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、KH2PO4、12H2O·Na2HPO4、7H2O·MgSO4、苏丹染液均为分析纯。

梅特勒 FE28-standard pH测定仪；FTA1000B表面张力测试仪。

1.2 培养基

菌种活化培养基为液体LB(Luria-Bertani培养基)，培养基营养物质比例(质量百分数)：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%。

基础发酵培养基(g/L)：蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L,KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

1.3 菌种活化及种子液制备

将菌种库冷冻甘油管中菌种接入装有 150 mL LB 液体种子培养基的 250 mL 三角瓶中，37 ℃，180 r/min 条件下振荡培养14 h，进行活化。取上述活化后的菌液，以同样的方式培养14 h，用作种子液。

1.4 摇瓶发酵

取种子液，以5%(V/V)接种量接入盛有150 mL 发酵培养基的 250 mL三角瓶中，置于摇床中，温度为37 ℃，转速为 180 r/min，振荡培养120 h，发酵完成后取发酵液测试排油圈与表面张力。

1.5 测试方法

脂肽产量用排油圈法[11]进行检测，其可靠性较高[12]。通过标准脂肽样品，可得排油圈直径与产量线性关系，并获得线性方程：y=(D-1.107)/0.009×n(其中D为排油圈直径，n为发酵液稀释倍数)。

表面张力使用表面张力测试仪进行测量。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基配方优化

2.1.1 培养基的单因素实验

2.1.1.1 碳源的优化 选取5种常规碳源,蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米浆干粉，用量均为30 g/L。初始培养基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH为7.5的条件下，进行SL-2的发酵，然后取样测定其排油圈直径，通过公式计算脂肽产量，最后测定表面张力，结果见图1、图2。其中CK为空白对照。

图1 碳源对脂肽产量的影响Fig.1 Effect of carbon source on lipopeptide yield

图2 碳源对表面张力的影响Fig.2 Influence of carbon source on surface tension

由图1可知，以蔗糖为碳源时，脂肽产量最高，达到2.39 g/L，且以糖类为碳源时，72 h后仍会继续发酵，而甘油和玉米浆干粉为碳源，则在72 h后停止发酵。由图 2可知,以蔗糖为碳源，发酵液表面张力从初始的67.2 mN/m降至25.1 mN/m，是5种碳源中表面张力降低幅度最大的。

2.1.1.2 氮源的优化 选取5种常规氮源酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、硝酸钠和氯化铵，用量均为3 g/L。初始培养基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH为7.5的条件下，进行SL-2的发酵，然后取样测定其排油圈直径，通过公式计算脂肽产量，最后测定表面张力，结果见图3和图4。

图3 氮源对脂肽产量的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on lipopeptide yield

图4 氮源对表面张力的影响Fig.4 Influence of nitrogen source on surface tension

由图3可知，以硝酸钠为氮源时，脂肽产量最高，可达2.6 g/L，氯化铵次之。72 h后，添加硝酸钠和氯化铵的两组继续发酵，对于营养物质的利用率较高，而添加有机氮源的三组停止发酵。由图4可知，使用硝酸钠或氯化铵，表面张力降低值最大，且终点表面张力最小。综合图3，图4可知，无机氮源更适合枯草芽孢杆菌的发酵。

在确定使用无机氮源后，为了探索NH4+和 NO3-两种不同离子形式氮源对表面活性剂产量的影响，固定总氮量为60 mmol/L，其他组分与基础培养基相同，分别单独使用硝酸钠和氯化铵，硝酸钠+氯化铵(1∶1)中，设置3组对照实验，结果见图5、图6。

图5 单种氮源与复配氮源对表面张力的影响Fig.5 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on surface tension

图6 单种氮源与复配氮源 对脂肽产量的影响Fig.6 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on lipopeptide yield

图7 单一氮源与混合氮源 对发酵液pH的影响Fig.7 Influence of single nitrogen source andmixed nitrogen source on pH of fermentation broth

由图5可知，3种氮源对于表面张力的降低几乎相同。由图6可知，酸钠+氯化铵混合氮源，脂肽产量远高于以氯化铵为氮源，略高于以硝酸钠为氮源。从经济性的角度考虑，氯化铵的价格较便宜，每吨比硝酸钠低30%左右，整体可以降低成本。从现场采油工艺考虑，由图7的 pH值可知，由于氯化铵加入较多，会导致发酵液pH降低，在采油工艺中，注入地下后，容易腐蚀破坏地层孔隙结构，导致地层压力不足，所以发酵液pH接近中性最好。安全性角度，硝酸钠有一定的危险性，用量越少越好。因此，综合以上4点考虑，选择硝酸钠+氯化铵的混合氮源最理想。

2.1.1.3 缓冲对的优化 由于在枯草芽孢杆菌发酵过程中会产生碱性物质，中性pH的发酵液对地层及周围环境也不会造成污染与损害。因此，为了使pH稳定在中性附近，需加入缓冲对进行调控，常见缓冲对组合为磷酸酸式盐，由于钠离子可以平衡渗透压，钾离子可以促进表生物表面活性剂合成后的分泌。因此，选择KH2PO4和12H2O·Na2HPO4作为缓冲对，调整培养基pH值至中性，使用KH2PO42.5 g，12H2O·Na2HPO430 g。

2.1.2 碳源、氮源、缓冲对用量正交优化 碳源、氮源、缓冲对3个因素在前面进行种类优化后再进行用量的优化，碳源和缓冲对方面，对比二者不同质量浓度对脂肽产量的影响，氮源方面，对比硝酸根型氮源与铵根型氮源不同的比例对脂肽产量的影响，因素与水平见表1，结果见表2。

表1 正交实验因素水平设计Table 1 Horizontal design of orthogonal experimental factors

表2 发酵培养基优化正交实验结果Table 2 Orthogonal test results of fermentation medium optimization

表3 正交实验方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiment

由表2可知，最佳组合为A3B3C2，因此优化后的培养基配方为：蔗糖50 g/L，硝酸钠∶氯化铵为2∶1，磷酸氢二钠+磷酸二氢钾为30 g+2.5 g。脂肽产量可达4.22 g/L 。由表3可知，RB>RC>RA,各因子对脂肽产量影响大小为：氮源比例>缓冲对>蔗糖。其中，氮源比例有显著影响，碳源和缓冲对在置信度不低于90%的情况下有一定的影响。

2.2 发酵条件

2.2.1 温度条件 温度主要通过改变酶反应速率来影响发酵结果。温度过低，酶活性较低，代谢较慢，产物生产效率也比较低，温度升高,酶会因为过热而失活，影响菌种生长发酵，从而影响最终的脂肽产量[13]。因此，选取细菌发酵常用温度37 ℃，并以3 ℃为间隔，设计34,37,40,43,46,49,52,55 ℃作为摇床温度进行发酵，控制发酵时间为96 h，测量各个温度下的脂肽产量,结果见图8。

由图8可知，枯草芽孢杆菌在37～45 ℃之间均可良好生长，并产脂肽，其中发酵的最适温度为37 ℃，而在高于49 ℃时不能进行正常生长发酵。

图8 温度对脂肽产量的影响Fig.8 Effect of temperature on lipopeptide yield

2.2.2 装液量 枯草芽孢杆菌生长繁殖需要氧气参与，当装液量过少时，会导致发酵液中溶氧过高，菌体代谢加快，培养基中营养物质消耗快，造成营养失衡，发酵后期菌体因为营养不足而凋亡；而当装液量超出一定范围后，溶氧量会显著降低，菌体有氧呼吸作用受到影响，代谢变慢，从而影响脂肽产量[14]。装液量对脂肽产量的影响见图9。

图9 装液量对脂肽产量的影响Fig.9 Influence of liquid loading volume on lipopeptide yield

由图9可知，装液量低于150 mL，对于脂肽产量影响较小，装液量超过150 mL时，脂肽产量下降。因此选150 mL最佳。

2.2.3 发酵时间 发酵时间对脂肽产量的影响见图10。

图10 脂肽产量随发酵时间的变化Fig.10 Variation of lipopeptide yield with fermentation time

由图10可知，在第100 h时脂肽产量达到最大，继续发酵，产量不再增加。因此，最佳发酵时间可确定为100 h。

3 结论

(1)枯草芽孢杆菌的优化培养基配方为：蔗糖50 g/L，NaNO33.4 g/L，NH4Cl 1.1 g，KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

(2)枯草芽孢杆菌的最佳培养条件：温度37 ℃，装液量150 mL，发酵时间100 h，脂肽平均产量可达4.2 g/L。

(3)通过NH4Cl的加入，减少了NaNO3的用量，在采油工业中，使每吨氮源成本降低30%左右。实现了采油枯草芽孢杆菌降低成本、保证产量的发酵。