基于网络药理学分析当归活血汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制

王继雪 袁星星 于文慧 吕勃川 赵钢

摘要 目的：分析当归活血汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的有效活性成分及靶点的药理作用。方法：通过中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）筛选当归活血汤有效活性成分及靶点，运用GeneCard及OMIM数据库获取下肢动脉硬化閉塞症（ASO）相关蛋白;通过String平台对药物-疾病靶蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建，利用DAVID数据库，将所得到的当归活血汤-下肢ASO靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：当归活血汤药物有效活性成分234个，当归活血汤-下肢ASO作用靶点共26个;PPI网络分析结果发现IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10等可能是当归活血汤治疗ASO的关键靶点。共获得46条GO生物过程和167条相关信号通路，其中HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路与下肢ASO的治疗密切相关。结论：基于网络药理学探究当归活血汤主要成分的靶点网络及其治疗下肢ASO的作用机制，为进一步对本病的基础实验研究提供新思路及科学依据。

关键词 当归活血汤;下肢动脉硬化闭塞症;靶点;作用机制;网络药理学

Mechanism of Danggui Huoxue Decoction in the Treatment of Arteriosclerosis Obliterans of the Lower Extremities Based on Network Pharmacology

WANG Jixue1，YUAN Xingxing1，2，YU Wenhui3，LYU Bochuan3，ZHAO Gang3

（1 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150006，China; 3 Department of Peripheral Vascular Diseases，the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective：To analyze the active components of Danggui Huoxue Decoction in the treatment of arteriosclerosis obliterans（ASO） of the lower extremities and the pharmacological effect of its target.Methods：By TCMSP database，we screened the effective active ingredients and targets of Danggui Huoxue Decoction and we used GeneCard and OMIM database to obtain lower limb ASO-related proteins; we used String platform to construct PPI network for drug-disease target proteins，and used DAVID database to obtain Danggui Huoxue Decoction-lower ASO target for GO function and KEGG pathway enrichment analysis.Results：Danggui Huoxue Decoction had 234 active ingredients，and Danggui Huoxue Decoction-lower limb ASO had 26 targets; In PPI interaction network analysis it was found that IL-6，VEGFA，MMP-9，IL-10，etc.may be the treatment of Danggui Huoxue Decoction for the key target of ASO.A total of 46 GO biological processes and 167 related signal pathways were obtained，of which HIF-1，AGE-RAGE，IL-17，TNF and other signal pathways were closely related to the treatment of lower extremity ASO.Conclusion：Based on network pharmacology，the target network of the main components of Danggui Huoxue Decoction and its mechanism of action in the treatment of lower limb ASO are explored，which provides new ideas and scientific basis for further basic experimental research on this disease.

Keywords Dangguihuoxue Decoction; Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Target; Mechanism of action; Network pharmacology

中图分类号：R211;R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.010

下肢动脉硬化闭塞症（Arteriosclerosis Obliterans，ASO）是外周血管疾病中最常见的一种因动脉硬化斑块所致的下肢动脉闭塞性疾病。间歇性跛行是临床早期出现的典型症状，随着病情加重逐渐发展为静息痛、严重者局部缺血部位出现大范围皮肤溃烂[1]。随着经济水平的不断增长，生命质量的不断提高，人口老龄化现象日益加剧，下肢ASO的发病率呈现逐年上升的趋势[2]。据不完全统计，目前我国约有2 000万人罹患本病，以老年男性者居多。研究显示，70岁以上人群中发病率约为20%，而在70岁以下人群中则为3%～10%[3-4]。截至2010年，全球罹患下肢ASO的患者高达2.02亿。随着糖尿病、吸烟、高血压、高脂血症等高风险因素发病率的不断上升[5]，使下肢ASO成为世界范围内备受关注的健康问题[6]。

当归活血汤最早见于明·《伤寒六书》，主要功效为活血化瘀。经后世医家辨病化裁，成为治疗不同疾病的经典方剂，分别记载于《眼科全书》《症因脉治》《医方考》等古籍中。目前，由当归、赤芍、川芎、丹参、黄芪、鸡血藤、甘草组成的当归活血汤多用于治疗中医脱疽病。机制研究方面，当归活血汤具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化应激、改善下肢微循环等药理作用[7]，目前其治疗下肢ASO的药效研究尚处于基础的临床观察阶段[8-9]，网络药理学作为新兴的中药研究方法，可对中药多成分、多靶点进行整体研究，挖掘其潜在的作用机制。现基于网络药理学，探究当归活血汤治疗下肢ASO的作用机制。

1 材料与方法

1.1 当归活血汤活性成分筛选

基于中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP），以“当归”“赤芍”“丹参”“黄芪”“川芎”“鸡血藤”“甘草”为检索词，选取当归活血汤中所含中药的化合成分。以口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，过滤获取每味中药的化合成分及对应的药物靶点。

1.2 药物-疾病靶点网络可视化分析

利用GeneCard及OMIM数据库以“Arteriosclerosis occlusion”为检索词，收集下肢ASO靶点。运用Interactivenn平臺上（http：//www.interactivenn.net/）将药物活性成分-疾病共同蛋白进行提取，所得交集即为Drug-Disease靶点。通过Cytoscape 3.7.1软件对Drug-Disease进行可视化网络分析。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

将Drug-Disease结果传至String平台进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。设定物种为“Homo sapiens”，设定最低互动分数为0.400[10]。运用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析。

1.4 GO功能及KEGG富集分析

将Drug-Disease结果输入至DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，分别通过OmicShare平台（http：//www.omicshare.com/）和Cytoscape 3.7.1软件对GO和KEGG富集分析结果进行可视化。

2 结果

2.1 当归活血汤活性成分的筛选

共检索得到当归活血汤所有活性成分234个，根据OB值将各药物排名前5的有效活性成分基本信息见表1。

2.2 药物-疾病靶点（Drug Disease Target，DDT）网络构建及可视化

共得到当归活血汤中146个药物靶点，通过GeneCard，OMIM上检索到关于下肢动脉硬化闭塞症的617个靶点，将二者进行交集处理，共得到26个药物疾病靶点。见图1。利用Cytoscape 3.7.1软件对DDT进行网络可视化。见图2。

2.3 PPI网络的构建及可视化

通过String平台对得到的26个药物疾病靶点进行PPI网络构建，然后利用Cytoscape软件对PPI结果行网络可视化分析。PPI网络最终得到共包含26个节点，208条边。根据Degree值对节点进行排序，排名前5的靶点为IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2。见图3。

2.4 GO富集分析

将所得到的26个药物疾病靶点，通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，共得到46条功能注释。通过OmicShare平台对BP、MF和分子功能排名，根据P值和富集靶点数靠前的GO富集分析结果进行排序。见图4，表2。

2.5 KEGG富集分析

通过DAVID平台对26个DDT进行KEGG富集分析，共得到167条富集通路，富集排名靠前的通路主要有HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路密切相关。见图5，表3。通过Cytoscape 3.7.1软件对DDT与富集通路进行可视化网络。见图6。

3 讨论

下肢ASO是全身动脉硬化在肢体的局部表现。动脉粥样硬化的病因尚不明确，医学界普遍认为其发病机制与血栓形成、脂质浸润、内膜损伤、炎症反应、免疫反应、氧化应激、血管平滑肌细胞激活等有关。目前，越来越多的研究证实炎症反应在ASO过程中扮演重要角色，这也是现阶段下肢ASO研究的重要切入点之一。通过对当归活血汤治疗下肢ASO的成分-靶点进行网络分析发现，本方中所含药物包括多种化学成分，且不同成分可以作用于多个靶点，充分体现中药组方多成分、多靶点相互协同作用。

本研究通过收集、筛选当归活血汤中所含药物，共得到234个活性成分，主要有芒柄花素、川芎哚、丹参酮ⅡA等能够预防及延缓ASO的形成。现代药理研究发现，芒柄花素具有降脂、抗脂质过氧化，改善AS病变[11];此外，芒柄花素还能够抑制平滑肌细胞增殖及迁移。赵培等[12]通过研究芒柄花素上调SR-BI蛋白表达，抑制主动脉壁泡沫细胞形成及平滑肌细胞增殖，达到预防和延缓ASO的形成和发展。血小板聚集和血栓形成是ASO形成的主要病理基础。唐刚华等[13]研究发现川芎哚（川芎Ⅲ号碱）具有抗凝、降低全血黏度及红细胞聚集、改善血液流变学及轻度增强红细胞变形的作用，寻找抗血小板聚集和抗血栓形成的药物对于防治ASO意义重大[14]。符杰等[15]研究表明丹参酮ⅡA可通过减少大鼠主动脉内皮细胞分泌ADMA，抑制eNOS降解，促进NO分泌，达到抑制血管收缩，预防ASO形成。进一步对活性成分靶点进行预测，得出146个对应的潜在靶点，通过检索相关数据库共获得与下肢ASO疾病相关的靶点617个，利用VENNY网络筛选出当归活血汤与下肢ASO共同作用靶点26个，体现了当归活血汤的整体协同作用。

PPI网络分析显示，当归活血汤中药物作用的靶蛋白与下肢ASO的作用靶蛋白，二者之间存在复杂的作用关系。通过IL-6、STAT3、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2，炎症介质、血管生长因子、黏附分子、多种酶等靶点相互作用，起到抗动脉硬化的作用。诸多研究提示斑块内活动性炎症与斑块的稳定性相关[16]。IL-6是一种具有广泛生物学效应的炎症介质，尤其在纤维帽及粥样斑块高表达水平，参与ASO及斑块破裂的全过程，通过与受体结合可诱导STAT3的活化。卢素宏等[17]研究证实，IL-6可激活IL-6/STAT3信号通路传导，介导组织炎症和细胞增殖。ICAM-1、VCAM-1等黏附分子参与AS慢性炎症反应全过程，聚集反应增强，在影响斑块形成的同时还影响斑块稳定性。IL-6还可以刺激基质金属蛋白酶（MMP），其升高分解了EMC的核心物质胶原纤维，使纤维帽变薄，诱导动脉斑块破裂。故认为MMPs的增多可严重影响斑块稳定性。MMP-2和MMP-9同属于基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）家族成员，在Endothelin-1、IL-1β、Ang-Ⅱ、TNF-α、缺氧等因素的诱导下，明胶酶MMP-2和MMP-9不断上调，酶解ECM中的Ⅳ型胶原，致其组织形态发生改变[18]。哈略和趙百孝[19]通过积极干预降低主动脉内MMP9含量，达到促进斑块稳定性的效果[20]。此外，MMP-2能够加速细胞外基质降解，在斑块形成后促进平滑肌细胞增殖和迁移，有利于单核巨噬细胞、平滑肌细胞及淋巴细胞向内膜下迁移，增加ASO斑块的易损性[21-22]。而IL-10是一种多效单链糖蛋白，其抗炎机制在ASO斑块的形成和稳定中起到保护作用[23]，IL-10较IL-4突出的一点即其可通过抑制核因子κB发挥抗炎机制，但其抗凋亡机制是否起到稳定AS斑块的作用尚有争议。同样，动脉内皮细胞的损伤和功能失调也参与ASO发生发展，秦臻和黄水清[24]研究发现，当归补血汤可通过促进内皮受损后VEGF及SDF-1的释放，诱导EPCs增殖，VEGF可使受损缺血部分EPCs大量聚集，促进血管新生。黄水清等[25]通过调控与炎症介质关系密切的核因子κB及P38MAPK通路保护内皮细胞。以上靶蛋白的相互协同作用、可能是当归活血汤治疗下肢ASO的主要作用机制。

我们对当归活血汤治疗下肢ASO进行GO富集分析发现，当归活血汤通过多靶点、多结构、多形式参与生物学进程，主要涉及细胞增殖、转录因子活性、抗氧化活性等，与下肢ASO发生发展过程中的炎症反应[26]、免疫反应[27]、氧化应激损伤[28]等相互作用，验证出网络药理学的合理性和可靠性。KEGG通路分析结果显示，当归活血汤治疗下肢ASO主要涉及HIF-1、AGE-RAGE、IL-17等与炎症、氧化应激相关的通路，本研究发现IL-6、VEGFA、STAT3等基因主要富集在HIF-1信号通路，HIF-1作为机体微环境缺氧的关键转录调控因子，在缺血缺氧的条件下，HIF-1合成增加，并通过VEGF、Ang-Ⅱ合成等方式促进血管形成。IL-6、VEGFA、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、STAT3等主要富集于AGE-RAGE信号通路上，RAGE是导致ASO发生的重要膜受体[29]。AGEs和受体相互作用，可引起氧化应激等反应，导致血管通透性增加、管壁增厚、脂质蛋白沉积，并可导致动脉粥样硬化。郭晓华等[30]实验证明AGE可通过与RAGE结合引发氧化应激，引起细胞内信号转导，导致内皮细胞通透性增高。莫中成等[31]发现AGEs诱导内皮细胞表达VCAM-1和ICAM-1，可能是其促动脉粥样硬化发生发展的一个重要机制。AGE与RAGE结合，可诱导内皮细胞发生氧化应激。MMP9、IL-6、IL-4主要富集于IL-17信号通路，国外研究发现IL-17A在炎症发生过程中起着重要作用[32]。研究认为IL-17A的增多促进下肢ASO的发生和发展[33]，但Danzaki等[34]通过对ApoE-/-小鼠实验发现认为IL-17A表达水平的缺陷是促进动脉粥样斑块进展的主要诱因和条件。IL-6、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1等均富集于TNF信号通路，TNF-α作为一种强效炎症介质，参与多种细胞行为。TNF-α由单核-巨噬细胞产生后直接作用于内皮细胞，并通过多重路径诱导细胞损伤，促进平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡，影响ASO斑块的稳定性。付建玉[35]在研究TNF-α的缺失对小鼠AS的影响发现，TNF-α的缺失会降低血脂水平，使炎症反应减轻，延缓ASO的形成与发展[36]。再次说明多生物途径、多信号通路相互协同作用是当归活血汤治疗下肢ASO主要的机制研究基础。

4 结论

当归活血汤通过234个活性成分作用于26个靶点，167条信号通路，主要通过抗炎、抗氧化应激、抑制平滑肌细胞的增殖、降解细胞外基质等途径，稳定ASO斑块、保护内膜等协同作用来治疗下肢ASO，为深入探讨当归活血汤治疗下肢ASO的效应机制提供基础。

参考文献

[1]谈洪统，李威，郭欢庆，等.药物涂层球囊PTA治疗下肢动脉硬化闭塞症[J].中国介入影像与治疗学，2019，16（12）：709-712.

[2]田珂，常超.经皮腔内血管成形术/支架植入术联合瑞舒伐他汀治疗下肢动脉硬化闭塞症远期疗效分析[J].中华实验外科杂志，2019，36（1）：175-176.

[3]Criqui MH，Aboyans V.Epidemiology of peripheral artery disease[J].Circ Res，2015，116（9）：1509-1526.

[4]Fowkes FG，Rudan D，Rudan I，et al.Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010：a systematic review and analysis[J].Lancet，2013，382（9901）：1329-1340.

[5]Yang SH，Dou KF，Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362（25）：2425-6; author reply 2426.

[6]王鹏，陈晓伟，包晗，等.药物涂层球囊与金属裸支架治疗下肢动脉硬化闭塞症效果和安全性对比[J].介入放射学杂志，2019，28（12）：1176-1180.

[7]陆小华，马骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46（4）：595-602.

[8]王亚蒙，魏纹瑶，秦炜，等.当归活血汤联合西药治疗糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症[J].中医临床研究，2020，12（9）：31-32.

[9]靳建旭，刘文胜.中医药治疗老年人下肢动脉硬化闭塞症20例[J].新中医，2005，37（3）：71-72.

[10]Szklarczyk D，Gable AL，Lyon D，et al.STRING v11：protein-protein association networks with increased coverage，supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D607-D613.

[11]王健，孙瑜，陈磊，等.芒柄花素的现代研究进展[J].山西中医学院学报，2017，18（5）：74-76.

[12]赵培，杨媛，徐扬，等.刺芒柄花素调节血脂代谢及改善动脉粥样硬化病变的实验研究[J].中国新药杂志，2009，18（10）：925-929.

[13]唐刚华，姜国辉，唐小兰.川芎哚及其类似物对凝血功能和血液流变学的影响[J].中国药理学通报，2002，18（2）：238-239.

[14]官杰，冯兴中，刘剑刚.鸡血藤防治动脉硬化相关药理作用的研究进展[J].中药新药与临床药理，2019，30（3）：385-389.

[15]符杰，林梅，李文华，等.丹参酮ⅡA对糖尿病大鼠主动脉内皮细胞非对称性二甲基精氨酸和一氧化氮的影响[J].中国动脉硬化杂志，2011，19（12）：1005-1007.

[16]Mauriello A，Sangiorgi G，Fratoni S，et al.Diffuse and active inflammation occurs in both vulnerable and stable plaques of the entire coronary tree：a histopathologic study of patients dying of acute myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2005，45（10）：1585-1593.

[17]卢素宏，姚丽梅，刘瑶，等.通瘀煎对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响及机制[J].中国老年学杂志，2020，40（8）：1745-1750.

[18]孔亚茹，周小枫，熊浩铭，等.基质金属蛋白酶MMP2和MMP9在哺乳动物卵泡发育中的作用研究进展[J].广东农业科学，2020，47（3）：103-110.

[19]哈略，赵百孝.艾灸对动脉粥样硬化小鼠炎性反应因子及MMP-9的实验研究[J].世界中医药，2016，11（8）：1389-1394.

[20]張华，王思静，马学宽，等.新塔花水提物对ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠血清中IL-6、IL-10表达的影响[J].中华中医药杂志，2019，34（7）：3258-3261.

[21]郑玮，杨向红.内皮细胞与单核细胞相互作用对基质金属蛋白酶2和其组织抑制剂2分泌和活化的影响以及普伐他丁的作用[J].中华病理学杂志，2005，34（2）：105-108.

[22]Lacerda L，Faria AP，Fontana V，et al.Role of MMP-2 and MMP-9 in resistance to drug therapy in patients with resistant hypertension[J].Arq Bras Cardiol，2015，105（2）：168-175.

[23]Pinderski LJ，Fischbein MP，Subbanagounder G，et al.Overexpression of interleukin-10 by activated T lymphocytes inhibits atherosclerosis in LDL receptor-deficient Mice by altering lymphocyte and macrophage phenotypes[J].Circ Res，2002，90（10）：1064-1071.

[24]秦臻，黄水清.当归补血汤对动脉粥样硬化兔内皮祖细胞及血清VEGF、SDF-1的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（2）：211-215.

[25]黄水清，沈小燕，韩凌，等.当归补血汤含药血清对ox-LDL激活单核细胞p38 MAPK的作用[J].中药新药与临床药理，2010，21（5）：458-461.

[26]肖安华，李虹维，颜春鲁，等.中药复方与有效成分调控NF-kB/MAPKs/JNK信号通路介导炎症反应抗AS的研究进展[J].中医药学报，2019，47（6）：109-114.

[27]李梦豪，卢浩，熊浩伟，等.以T淋巴细胞为靶点抗动脉粥样硬化的新进展[J].中国循环杂志，2015，30（8）：807-810.

[28]赵伟，王倩，王立新，等.高压氧增强西红花苷对小鼠动脉粥样硬化的治疗作用[J].中华航海医学与高气压医学杂志，2019，26（4）：354-356.

[29]Basta G，Lazzerini G，Massaro M，et al.Advanced glycation end products activate endothelium through signal-transduction receptor RAGE：a mechanism for amplification of inflammatory responses[J].Circulation，2002，105（7）：816-822.

[30]郭晓华，陈波，王述昀，等.晚期糖基化终产物诱导血管内皮细胞骨架形态改变的机制[J].中国动脉硬化杂志，2005，13（3）：282-286.

[31]莫中成，易光辉，米五平，等.糖基化终末产物对ECV-304细胞ICAM-1及VCAM-1表达的影响[J].中国心血管病研究杂志，2006，4（5）：367-369.

[32]Akitsu A，Iwakura Y.Interleukin-17-producing γδ T（γδ17） cells in inflammatory diseases[J].Immunology，2018，155（4）：418-426.

[33]Erbel C，Chen L，Bea F，et al.Inhibition of IL-17A attenuates atherosclerotic lesion development in apoE-deficient mice[J].J Immunol，2009，183（12）：8167-75.

[34]Danzaki K，Matsui Y，Ikesue M，et al.Interleukin-17A deficiency accelerates unstable atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-deficient mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（2）：273-280.

[35]付建玉.TNF-α缺失對小鼠动脉粥样硬化影响的研究[D].杭州：浙江大学，2004.

[36]周平，罗云，邢娜，等.肿瘤坏死因子α介导动脉粥样硬化发生机制的研究进展[J].世界中医药，2015，10（8）：1163-1168.

（2020-07-01收稿 责任编辑：杨觉雄）