基于网络药理学探讨健脾益肾化浊方治疗卒中后认知障碍的作用机制曾子修 申伟 魏竞竞

曾子修 申伟 魏竞竞 王敏 王莹 张昕洋 金香兰 张允岭

摘要 目的：采用網络药理学方法探讨健脾益肾化浊方治疗卒中后认知障碍（PSCI）的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医药综合数据库（TCMID）及ETCM数据库筛选健脾益肾化浊方的活性成分，运用Swiss Target Prediction数据库对活性成分进行靶点预测;运用GeneCards数据库筛选PSCI相关疾病靶点;运用RStudio软件对健脾益肾化浊方及PSCI共同靶点绘制韦恩图;将二者共同靶点通过STRING及Metascape数据库分别进行PPI分析，基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析;运用Cytoscape 3.6.0绘制“健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路”网络图;采用AutoDock对核心成分及核心靶点进行分子对接验证。结果：筛选出健脾益肾化浊方39种活性成分和553个靶点，筛选出PSCI潜在靶点2 305个，二者共同靶点为254个。通过GO及KEGG富集分析，发现健脾益肾化浊方可能通过突触可塑性、抗细胞凋亡、抗炎等多靶点、多途径发挥对PSCI的治疗作用。分子对接结果提示活性成分Stigmasterol与核心靶点（MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1），Palmatine与核心靶点（AKT1）具有较好的结合活性。结论：健脾益肾化浊方治疗PSCI可能通过调节突触可塑性、抗细胞凋亡、抗炎等生物学过程发挥作用。

关键词 健脾益肾化浊方;卒中后认知障碍;网络药理学;作用机制;中药;靶点;信号通路;分子对接

Mechanism of Jianpi Yishen Huazhuo Formula in Treatment of Post Stroke Cognitive Impairment Based on Network Pharmacology

ZENG Zixiu1，SHEN Wei2，WEI Jingjing1，WANG Min1，WANG Ying1，ZHANG Xinyang1，JIN Xianglan3，ZHANG Yunling2

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 3 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription in treatment of post stroke cognitive impairment （PSCI） by using network pharmacology method.Methods：TCMSP，TCMID and ETCM databases were used to screen the active ingredients of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription，and the Swiss Target Prediction database was used to predict the target of the active ingredients.The GeneCards database was used to screen PSCI related disease targets.RStudio software was used to draw the Wien diagram for the common targets of the Jianpi Yishen Huazhuo Formula and PSCI.The PPI analysis，GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were performed on the 2 common targets through the String and Metascape databases.Cytoscape 3.6.0 was used to draw the network diagram of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription-target point-PSCI-pathway.The AutoDock was used for molecular docking verification of core components and core targets.Results：A total of 39 active ingredients and 553 targets of the Jianpi Yishen Huazhuo Formula were screened out，and the 2305 potential targets of PSCI were screened out，among which the common targets were 254.Through the GO and KEGG enrichment analysis，it was found that the Jianpi Yishen Huazhuo Formula might play a therapeutic effect on PSCI through multiple targets and pathways such as synaptic plasticity，anti-apoptosis and anti-inflammation.The molecular docking results indicated that the active component Stigmasterol had good binding activity with the core target （MAPK1，Src，MAPK3，TP53，HSP90Aa1） and Palmatine had good binding activity with the core target （AKT1）.Conclusion：The Jianpi Yishen Huazhuo Formula may play an important role in the treatment of PSCI by regulating synaptic plasticity，anti-apoptosis and anti-inflammation.

Keywords Jianpi Yishen Huazhuo Formula; Post stroke cognitive impairment; Network pharmacology; Mechanism; Chinese medicinals; Target; Signaling pathway; Molecular docking

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.009

卒中后认知障碍（Post Stroke Cognitive Impairment，PSCI）特指卒中后发生的认知功能下降，是血管性认知障碍（Vascular Cognitive Impairment，VCI）的一个重要亚型。基于我国的一项流调研究显示，PSCI的总体患病率高达80.97%，严重影响患者生命质量及生存时间[1]。目前研究显示，PSCI的病理机制可涉及神经炎症、氧化应激、血管内皮功能失调、神经退行性及神经传递等多种不同分子信号途径[2]。当前尚无针对PSCI病理干预的药物应用于临床，注重PSCI的早期筛查和预防兼以积极控制血管危险因素、加强认知康复训练等是当前管理PSCI的重要策略[3]。

PSCI属于中医学“中风”合并“健忘”“呆病”范畴。其发病基本病机以脾肾亏虚为本，痰浊瘀血之实痹阻脑脉为标[4]。由此，治疗强调以补肾填精为主，化痰祛瘀为辅[5]。健脾益肾化浊方由肉苁蓉、益智仁、远志、红景天及黄连5药组成，具有健脾益肾，祛痰化浊之功。本团队在前期开展的多中心、随机、双盲、安慰剂对照的临床研究中已证实健脾益肾化浊方能有效改善缺血性卒中患者认知功能，然其起效机制尚缺乏探究。现运用经典的网络药理学研究方法对健脾益肾化浊方治疗PSCI的潜在药理学机制进行预测分析，以期为进一步实验研究提供前期依据。研究流程见图1。

1 资料与方法

1.1 健脾益肾化浊方化合物查找及活性成分筛选  健脾益肾化浊方中肉苁蓉、益智仁及黄连三药所含的化合物在中药系统药理数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.Com/tcmsp.php）中查找，并运用TCMSP中自带的药物ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）筛选功能，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）、类药性（Drug Likeness，DL）和血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）透过率作为筛选指标，根据文献[6]以OB30%、DL0.8、BBB-0.3为筛选标准，获取上述3种药物的活性成分;因远志和红景天含有的化合物在TCMSP中检索不到，故在中药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）及中医药百科全书数据库（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http：//www.tcmip.Cn/ETCM/index.php/Home/Index/）中查找，并运用SwissADME数据库[7]（http：//www.swissadme.ch/）对所查到的化合物进行ADME筛选，选取胃肠道吸收高、类药性好并能通过血脑屏障的化合物为远志及红景天二药的活性成分。

1.2 健脾益肾化浊方潜在靶点筛选

运用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）先对查找到的活性成分进行确证，得到活性成分相对应的2D结构，再通过Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstarget-prediction.ch/）对活性成分进行靶点预测。并以物种属性为Homo Sapiens，靶点可靠性>10%作为筛选条件，以此收集符合要求的靶点。

1.3 卒中后认知障碍相关靶点的检索及筛选

在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中，以“Post Stroke Cognitive Impairment”为关键词，寻找PSCI相关的治疗靶点。参照同类研究[8]，以Score值大于中位数为筛选条件，筛选与PSCI联系密切的潜在靶点。而后通过RStudio软件中的VennDiagram R包绘制PSCI和健脾益肾化浊方共同靶点的韦恩图[9]。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及对核心靶点的筛选

在STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/）中，以生物种类为“Homo Sapiens”及最小相互作用阈值为“Highest Confidence”（>0.9）为设置条件，对健脾益肾化浊方和PSCI的共同靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络图的构建。后运用可视化软件CytoScape 3.6.0中內置插件“Network Analyzer”对PPI网络进行拓扑分析，以度数（Degree）作为主要的拓扑指标，Degree值越大，说明该节点在网络中越重要。选择Degree值排名靠前的基因作为健脾益肾化浊方治疗PSCI的核心靶点。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析及可视化

将健脾益肾化浊方与PSCI的共同靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html），并设置生物物种为Homo Sapiens，P<0.01，然后分别进行GO及KEGG通路富集分析。运用imageGP在线作图网站（http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/home/index/boxplot.html）对数据进行可视化。

1.6 “健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路”网络图的构建

运用Cytoscape 3.6.0软件绘制健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路网络图，并对其进行网络拓扑结构的分析，按照Degree值大小筛选排名靠前的活性成分作为健脾益肾化浊方的核心成分。

1.7 健脾益肾化浊方核心成分与其治疗PSCI核心靶点的分子对接

对健脾益肾化浊方的核心成分与其治疗PSCI的核心靶点进行分子对接。首先在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载核心成分的3D分子结构，并利用Open Babel GUI软件将其转换成mol2格式。在PDB数据库（https：//www.rcsb.org）检索靶基因蛋白构象，并使用PyMOL软件对蛋白进行脱水处理，并以.pdb格式导出。利用AutoDock软件进行蛋白-分子对接，并进行结合能（Binding Energy）评分。最后使用PyMOL软件对具有最佳结合能的分子对接情况进行可视化呈现。

2 结果

2.1 健脾益肾化浊方活性成分及潜在靶点

依照上述筛选标准，去重后共得出健脾益肾化濁方39种活性成分及553个靶基因。见表1。利用Cytoscape 3.6.0软件，将健脾益肾化浊方39种活性成分和553个有效靶点建立健脾益肾化浊方活性成分-靶点网络图。见图2。

2.2 卒中后认知障碍（PSCI）潜在靶点

从GeneCards数据库检索到PSCI已知靶点共4 615个。通过GeneCards所得PSCI靶点Score最大值为91.39，最小值为0.27，中位数为5.69，故设定Score>5.69的靶点为PSCI的潜在靶点。最终得到2 305个PSCI潜在靶点。

2.3 健脾益肾化浊方与卒中后认知障碍（PSCI）共同靶点的PPI网络图

以取交集的方式，获得健脾益肾化浊方活性成分-PSCI共同靶点254个，通过RStudio软件绘制二者共同靶点的韦恩图。见图3。将上述254个共同靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，再运用CytoScape 3.6.0软件对PPI网络进行美化及拓扑结构分析。见图4。按照Degree值从大到小，获取蛋白互作关系排名前10名的靶点，分别为PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3、MAPK3、AKT1、TP53、HSP90AA1、EP300，以此作为健脾益肾化浊方治疗PSCI的核心靶点。见图5。

2.4 GO功能富集分析情况

运用Metascape 数据库对254个药物成分-疾病共同靶点分别进行生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）的富集分析，并根据富集基因数值（Count）大小，分别筛选出排名前10的条目并绘制条形图。见图6。通过GO分析，健脾益肾化浊方主要参与的生物学过程主要为细胞对氮化合物的反应（Cellular Response to Nitrogen Compound）、激酶活性的正调节（Positive Regulation of Kinase Activity）、MAPK级联的调节（Regulation of MAPK Cascade）、跨突触信号（Trans-Synaptic Signaling）、化学突触传递（Chemical Synaptic Transmission）等;细胞组分主要富集于树突（Dendrite）、轴突（Axon）、神经元胞体（Neuronal Cell Body）、细胞膜区（Membrane Region）等;分子功能主要富集于激酶活性（Kinase Activity）、磷酸转移酶活性（Phosphotransferase Activity）、转录因子结合（Transcription Factor Binding）、氧化还原酶活性（Oxidoreductase Activity）等。

2.5 KEGG通路富集分析情况

运用Metascape数据库对254个药物成分-疾病共同靶点进行KEGG通路富集分析，并按照LogP值大小排序，筛选出排名前20的通路，绘制成气泡图。见图7。通过KEGG分析，发现富集较显著的通路大多与突触可塑性相关，其中包括：神经活性配体-受体相互作用通路（Neuroactive Ligand-Receptor Interaction）、Ras信号通路（Ras Signaling Pathway）、Rap 1信号通路（Rap 1 Signaling Pathway）、Camp信号通路（Camp Signaling Pathway）、MAPK信号通路（MAPK Signaling Pathway）、神经营养素信号通路（Neurotrophin Signaling Pathway）、5-羟色胺能突触信号通路（Serotonergic Synapse）、磷脂信号通路（Sphingolipid Signaling Pathway）等。其余较显著的通路与细胞自噬及凋亡相关的有PI3K-AKT信号通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）;与炎症及凋亡相关的有HIF-1信号通路（HIF-1 Signaling Pathway）;与血管新生相关的有VEGF信号通路（VEGF Signaling Pathway）。

2.6 “健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路”网络图

将KEGG富集分析筛选出的20条信号通路，运用Cytoscape 3.6.0软件绘制“健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路”网络图，并进行网络拓扑结构分析，以Degree值调节网络中的节点大小程度，从而直观显示网络中节点的重要性。见图8。并按照Degree值大小筛选出排名前7的活性成分作为健脾益肾化浊方的核心成分。见表2。

2.7 分子对接结果

将上述7个健脾益肾化浊方的核心成分与其治疗PSCI排名前10的核心靶点进行分子对接，将对接分值≤-6的分子对接结果绘制为表3，结合能分值越小提示对接越好，且分值<-7表示具有较好的结合活性[10]。从表中可发现，益智仁的活性成分Stigmasterol与MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1均具有较好的结合活性，黄连的活性成分Palmatine与AKT1具有较好的结合活性。其中Stigmasterol与HSP90AA1结合活性最高，Stigmasterol与HSP90AA1的分子对接细节模拟。见图9。Stigmasterol与HSP90AA1活性位点的ASP93形成一个氢键相互作用。

3 讨论

认知障碍是脑卒中常见的并发症，不同于AD等神经系统退行性疾病引起的认知障碍，PSCI具有可防可治的特点[3]。许多病理研究发现，PSCI通常是“血管”损伤和神经退行性病变混合作用的结果，而非一个特殊神经病理过程[11]，因此PSCI兼备卒中及认知障碍的病理机制。由此，根据PSCI导致神经元损伤的多重复杂分子机制，进行药物治疗PSCI的潜在靶点亦是多维度多层面的。

研究发现，中药可通过减轻神经损伤及促进神经修复两大方面来改善卒中引发的认知功能减退，具体表现在可通过清除自由基、抗炎、抑制细胞凋亡、调节突触可塑性、调节中枢胆碱能系统及降低淀粉样蛋白沉积等途径促进卒中后认知功能恢复[12]。本团队通过文献调研及临床对PSCI患者证候要素分布的观察总结，认为肾脾亏虚、痰瘀互结为其重要病理因素[13]。自拟健脾益肾化浊方由《备急千金要方》中的苁蓉散加减化裁而来，全方由5位药（肉苁蓉，益智仁，远志，红景天，黄连）组成。其中肉苁蓉为君药，其性味甘、咸、温，归肾、大肠经，功能补肾阳、益精血、润肠通便;益智仁性辛、温，归脾、肾二经，可温脾止泻摄唾、暖肾固精缩尿;红景天性甘、苦、平，归肺、脾、心经，可益气活血，通脉平喘;远志归心、肾、肺经，《神农本草经》曰：“……益智慧，耳目聪明，不忘，强志，倍力。”黄连味苦、寒，“久服令人不忘”，可清热燥湿，泻火解毒。肉苁蓉、益智仁、远志三药合用，共奏健脾益肾之效，红景天益气活血，通血脉以化痰浊，黄连为佐，清热化浊，清解瘀热。5药相合，能健脾益肾，祛痰化浊，发挥协同作用。

本研究采用网络药理学分析方法，先通过检索中药相关数据库，初步从健脾益肾化浊方中筛选出39个化合物。后通过构建“健脾益肾化浊方-靶点-PSCI-通路”网络图，按Degree值大小筛选出排名前7的化合物为健脾益肾化浊方治疗PSCI的核心化学成分。其中苏齐内酯（Suchilactone）、花生四烯酸（Arachidonate）均属于肉苁蓉的活性成分，植物甾醇（Stigmasterol）属于益智仁的活性成分。三者在认知障碍类相关疾病的研究较多，体内研究发现Suchilactone可通过降低Aβ蛋白的沉积来改善AD小鼠的空间学习和记忆能力[14];Arachidonate可通过抑制神经炎症反应[15]、促进神经递质传递[16]等途径改善认知功能;Stigmasterol则可通过增加抗氧化酶的活性、减轻氧化应激反应[17]、激活胆碱能神经传递系统[18]等促进小鼠认知功能恢复。在卒中研究方面，黄连成分黄藤素（Palmatine）可通过增加VEGF、Ang-1及AKT等蛋白的表达促进脑缺血大鼠神经新生[19]，且研究证实Palmatine具有较好的抗炎作用[20]，其对ERK1/2、P38、AKT/NF-κB等炎症信号通路有一定抑制作用[21]。后期分子对接证实Stigmasterol与核心靶点（MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1），Palmatine与核心靶点（AKT1）均具有较好的结合活性，故推测健脾益肾化浊方可能主要通过Stigmasterol、Palmatine等改善PSCI的认知功能。

本研究通过分析“健脾益肾化浊方-PSCI共同靶点PPI网络图”，以Degree值大小筛选出排名前10的靶点基因作为核心靶点，其中PIK3CA、PIK3R1[22]、MAPK1、MAPK3[23]、SRC[24]、AKT1[25]、STAT3[26]为当前研究认知障碍类疾病较常见的基因，可通过激活与细胞生长、成活、增殖、活力和形态有关的信号级联，介导突触可塑性、细胞增殖、血管新生等相关通路。HSP90AA1是一种非常重要的热休克蛋白，能影响细胞凋亡，发挥免疫作用。其可通过介入细胞凋亡信号通路而直接影响细胞凋亡，是细胞凋亡调控的关键因子。近年来，HSP90AA1逐渐向脑缺血疾病方向研究，且推测其可与HIF-lα特异性结合，从而发挥抗凋亡作用[27]。本研究在分子对接中发现活性成分Stigmasterol与HSP90AA1结合活性最佳，提示健脾益肾化浊方可通过调控HSP90AA1表达，影响细胞凋亡来改善PSCI的认知功能。

本研究通过KEGG通路富集分析发现，健脾益肾化浊方治疗PSCI的信号通路主要与突触可塑性、神经炎症、细胞自噬及凋亡等相关。主要涉及神经活性配体受体相互作用信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路等。突触可塑性是多种学习形式和记忆的分子基础，卒中可引起突触信号转导和结构破坏，从而导致认知功能障碍[28]。研究发现，神经活性配体受体相互作用信号通路可参与调控突触可塑性，是认知障碍类疾病最为常见的信号通路之一[29];MAPK通路是多条通路的下游信号，与神经突触可塑性、细胞凋亡、神经炎症均有关系[30]，动物研究发现，若有效抑制MAPK通路上相关蛋白的表达，可减轻炎症反应，减少细胞凋亡，从而改善脑缺血损伤大鼠认知功能[31];PI3K-AKT信号通路可调节细胞分裂、分化、迁移等生理过程，具有促进细胞成活、细胞自噬及抗凋亡的作用。研究發现，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路能促进脑缺血损伤大鼠海马CA1区自噬相关蛋白Beclin1及LC3表达，从而改善大鼠认知功能[32];HIF-1信号通路可通过激活多种途径，参与脑组织缺血缺氧的病理生理过程[33]。研究发现，HIF-1α可减轻大脑氧化应激和炎症反应，从而防御脑低灌注损伤引发的认知功能减退[34]。

综上所述，本研究通过网络药理学分析方法预测了健脾益肾化浊方治疗PSCI的有效成分及潜在靶点，并探讨了健脾益肾化浊方可通过多靶点、多通路来调节突触可塑性、抗细胞凋亡、抗炎等生物学过程，从而发挥改善PSCI的作用，为后续进行更加深入具体的分子机制研究提供了参考依据。

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（2021-01-20收稿 责任编辑：魏庆双）