基于QuEChERS-GC-MS/MS法同时测定湘产黄精中的74种农药残留

马杰，丁野，孙辉*，王湘波（1. 湖南省药品检验研究院，长沙 410001；2. 湖南省药品质量评价工程技术中心，长沙 410001）

黄精是百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed.或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效[1]，是药食同源的多用途植物，为我国常用大宗中药材品种。随着国内外对黄精开发的热度不断升温，特别是在营养保健、中国老年疾病预防等方面的需求增大，黄精的种植规模不断扩大。在黄精的各种来源中，尤以湖南产的多花黄精品质为上乘[2-3]。为了防治病虫害[4-5]，黄精药材种植者往往凭借经验用药，种植过程中乱用、滥用、误用农药时有发生，导致质量安全隐患，从而制约了黄精产业的发展和升级。目前，黄精中的农药多残留检测报道较少，缺乏较为系统、可靠的检测方法。

QuEChERS 法是近年来中成药中农药多残留成分较为常用的前处理方法之一[6-7]，具有快速（Quick）、简单（Easy）、廉价（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的优势，其利用吸附剂填料与样品基质中的杂质相互作用达到对供试品除杂净化的目的，以实现杂质的最低限度干扰。气相色谱-串联质谱联用（GCMS/MS）技术灵敏度高、专属性强，可一次完成对多种农药残留的痕量分析，目前已被广泛应用于中药材中农药多残留的测定。QuEChERS 联合GC-MS/MS，成功解决了各种复杂基质中药材中多种农药残留的检测问题[8-9]。

为实现对黄精药材中农药残留风险评价，本文建立了一种QuEChERS-GC-MS/MS 同时测定药材中74 种农药残留量的方法，并测定了湖南省内收集的4 批次黄精样品中的农药残留情况。

1 仪器与试药

7890B/7010 型三重四级杆气相色谱质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；AE240 型天平（德国梅特勒托利多公司）；EYELA CM-1000 高速震荡仪（上海爱朗仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；SHIMSEN样品前处理净化盐包（含无水硫酸镁6.0 g 与无水乙酸钠1.5 g），SHIMSEN 样品前处理净化材料[含无水硫酸镁900 mg、N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化炭黑90 mg，日本岛津公司]；冰醋酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为高纯水（经Milli-Q 超纯水器纯化）；74 种农药对照品溶液（批号：30765XT/30766XT/30767XT，质量浓度均为100 μg·mL－1，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代莠去津内标储备液（ethylamino D5，批号：20441XB，100 μg·mL－1）。4 批样品购自药材市场及中药饮片生产企业，产地均为湖南，经丁野主任中药师鉴定为黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[10-12]

HP-5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气，恒压模式，柱前压为124 kPa；进样口温度为280℃，脉冲不分流进样。程序升温：初始温度70℃，保持2 min，先以25 ℃·min－1升温至140℃，再以4℃·min－1升温至200 ℃，最后以7 ℃·min－1升温至280℃，保持8 min。

2.2 质谱条件

EI 源，70 eV，离子源温度为270℃，接口温度为280℃。碰撞气：氮气（纯度≥99.999%）；溶剂延迟：5 min；质谱监测模式：MRM 模式分段；每种化合物选择两对离子对。保留时间、离子对、碰撞能等如表1 所示。

表1 74 种农药的保留时间、监测离子对、碰撞电压(CE)Tab 1 Retention time，monitoring ion pairs and collision voltage of the 74 pesticides

续表1

2.3 溶液的配制

2.3.1 供试品溶液 将样品置于－18℃冷冻48 h后，立即粉碎得黄精粉末。取黄精粉末（过二号筛）3 g，精密称定，置于50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，加入超纯水15 min，涡旋使充分浸润，静置30 min；精密加入1%醋酸乙腈（取冰醋酸溶液1 mL，加乙腈至1000 mL）15 mL 和内标溶液100 μL，涡旋震荡5 min，冰浴冷却5 min，加入前处理净化盐包（含无水硫酸镁6.0 g 与无水乙酸钠1.5 g），涡旋混合5 min，离心5 min（8000 r·min－1）；取上清液9 mL 置于含SHIMSEN 样品前处理净化材料的塑料离心管中，涡旋混合1 min，离心，精密吸取上清液5 mL 置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 取对照品溶液，加含0.05%醋酸的乙腈配制成0.1 μg·mL－1和1 μg·mL－1的两种混合对照品溶液。

2.3.3 内标溶液的制备 取氘代莠去津内标储备液适量，加乙腈制成质量浓度为6 μg·mL－1的溶液。

2.3.4 空白基质的筛选 取黄精样品，按照“2.3.1”项下方法制备，进样分析，找出未检出74 种目标农药的空白基质样品，最终确认样品4为空白基质样品。

2.3.5 基质混合对照品溶液的制备 取空白样品3 g，共6 份，同“2.3.1”项下方法处理至“置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL”，分别加入混合对照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100 μL，混合对照品溶液（1 μg·mL－1）50、100、200、400 μL，加乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得基质混合对照品溶液，系列质量浓度分别为5、10、50、100、200、400 ng·mL－1。

精密吸取上述溶液各1 μL，进样测定，按标准曲线法计算供试品中74 种农药残留量。基质混合对照品溶液、检出样品溶液总离子流图见图1，检出农药的MRM 检测结果质谱图见图2。

图1 总离子流图Fig 1 TIC of 74 pesticides

图2 3 种检出农药的MRM 检测结果质谱图Fig 2 Typical mass chromatograms of MRM monitoring results of 3 pesticides

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系 精密吸取系列混合对照品溶液各1 μL，进样测定，记录各待测组分的色谱峰面积，以各成分的质量浓度为横坐标（X）、各成分峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），进行回归分析，结果表明，各农药对照品线性关系良好，见表2。

2.4.2 精密度试验 取“2.3.5”项下质量浓度为100 ng·mL－1的对照品溶液，分别精密吸取1 μL，进样测定6 次，计算各农药对照品峰面积的RSD，结果均小于15%（n＝6），表明仪器的精密度满足试验要求。

2.4.3 重复性试验 取同一黄精样品（1 号），共6 份，制成供试品后测定，样品检出杀虫脒、苯氟磺胺和腐霉利，故以样品中的杀虫脒、苯氟磺胺和腐霉利的峰面积计算含量后求得RSD，结果三者的RSD分别为6.3%、4.3%和5.9%，均小于15%，符合农药残留检测的要求。

2.4.4 加样回收试验 取空白样品3 g，共9 份，分别精密加入混合对照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100、500 μL，每个浓度各重复3 份，同供试品溶液的制备方法处理，即得加样回收对照品溶液。按“2.1”项下色谱质谱条件测定并计算回收率，结果平均回收率均在60%～140%的农药数占比为94.6%，RSD均小于15%，结果见表2。

2.4.5 检测限（LOD）与定量限（LOQ） 根据《中国药典》2015年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”中信噪比法计算检测限与定量限，以上述线性关系考察中质量浓度为5 ng·mL－1的各目标农药的信噪比。按3 倍信噪比对应的目标物浓度作为检测限，以10 倍信噪比对应的目标物浓度作为定量限，结果见表2。

表2 相关系数、线性范围、检测限、定量限和加样回收率Tab 2 Correlation coefficient，Linear range，LOD，LOQ and recovery

续表2

2.5 样品测定

按建立的方法处理并测定4 批收集的样品，结果见表3，样品中检出农药品种为杀虫脒、苯氟磺胺和腐霉利，其余农药均未检出。

表3 黄精农药残留测定结果(μg·kg－1)Tab 3 Determination of pesticide residues in 4 batches of Rhizoma Polygonati (μg·kg－1)

3 讨论

本文首次将 QuEChERS 前处理方法结合 GCMS/MS 检测技术用于黄精药材中多种农药残留的快速分析检测。

经前期调研，黄精以林下套种、杉树林下种植和大田种植等为主要生产模式，由于是多年生植物，使用农药消灭病虫害是保证黄精产量的重要方法之一，并且由于历史原因耕地土壤中有机氯类、有机磷类等农药品种会有较大残留，因此，本研究选择包含有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类在内的74 种农药品种作为对照较为全面。

对黄精饮片的前处理条件进行了三个方面的摸索，包括乙腈高速匀浆直接提取、直接提取＋PSA 固相萃取小柱净化和QuEChERS 法，结果QuEChERS 法能够较好地除去黄精样品中的多糖、色素等不利于农药测定的干扰杂质，降低了因污染对分析仪器稳定性的影响。黄精中含多糖成分较多，在粉碎和样品前处理过程中容易粘连结块，本试验在使黄精样品得到充分冷冻后再立即粉碎，在加入QuEChERS 前处理盐包之前冰浴冷却溶液，并在其后的步骤中控制好溶液温度，避免了粉碎和前处理样品过程中的结块现象。采用药典通则2341 项下推荐的质谱参数，部分农药品种的响应偏低，因此本研究对监测离子对、碰撞电压分别进行了优化。

本法74 种农药残留在4 ～400 ng·mL－1内线性关系良好，检测限和定量限分别在0.04 ～3.32 和0.14 ～11.05 mg·kg－1，3 个不同浓度添加水平的平均回收率在60%～120%的农药数占比为94.6%，RSD均小于15%，适用于不同基原的湘产黄精（黄精和多花黄精）的74 种农药残留检测，对湘产黄精生产种植中农药监控有一定意义。由于本次试验仅收集4 批次的样本，代表性不足，并不能完全反映湖南产黄精的农药污染真实情况。为实现湘产黄精的整体农残监控及用药安全的全面了解，可通过对产地农药使用习惯、土壤污染状况开展实地调研、收集更多产地的样品后，应用本研究建立的方法进行测定并进行风险评估。