高效液相色谱法测定克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量

郭丹峰，雷建刚，章泽恒（. 嘉实（湖南）医药科技有限公司，长沙 4027；2. 湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，长沙 4003）

克林霉素磷酸酯为化学半合成的克林霉素衍生物，体外无抗菌活性，在碱性磷酸酯酶作用下迅速水解为克林霉素，进而表达药理活性，其抗菌谱、抗菌活性及治疗效果与克林霉素相同。克林霉素磷酸酯和克林霉素相比，具有更优的脂溶性及渗透性，临床应用更加广泛[1-2]。克林霉素磷酸酯注射液中功能性辅料包括苯甲醇和依地酸二钠，苯甲醇含量的限度和检测方法已被《中国药典》收录[3]，依地酸二钠限度和检测方法未被收录，也无文献报道。

依地酸二钠作为金属离子螯合剂，可防止由原辅料、生产设备和包材引入的元素杂质催化药液发生氧化水解或生成絮状沉淀，提高药物的稳定性[4-5]，但其浓度过高时可能引起血钙浓度下降。为保证保障患者的用药安全，应建立克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量检测方法并对其含量进行有效控制。

1 材料

安捷伦1260 型高效液相色谱仪（Agilent Technologies Co. Ltd，USA）；梅特勒XS105DU型分析天平、梅特勒FE-28 型pH 计（METTLER TOLEDO，Switzerland）；Milli-Q 超纯水仪（Merck KGaA，Germany）。

依地酸二钠（批号：R028C1，纯度以100%计，USP）；甲醇（色谱纯，Sigma）；水为超纯水；甲酸（分析纯，国药集团）；25%四丁基氢氧化铵（分析纯，天津光复）；三氯化铁（分析纯，阿拉丁）；克林霉素磷酸酯注射液（批号：DP6232，辉瑞，规格为300 mg/2 mL，依地酸二钠的处方含量为0.5 mg·mL－1；批号：20063021，与辉瑞处方和规格相同的自制品）；按照参比制剂处方配制不含依地酸二钠的克林霉素磷酸酯注射液（批号：200615，自制）。

2 方法

2.1 色谱条件

照高效液相色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0512）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.006 mol·L－1的四丁基氢氧化铵溶液（取25%四丁基氢氧化铵溶液6 mL，加水至1000 mL，混匀，用甲酸调节pH 至3.5）为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0 ～15 min，75%A；15 ～30 min，75% ～20%A；30 ～31 min，20% ～75%A；31 ～40 min，75%A）；检测波长为254 nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL·min－1，进样量为20 μL。

2.2 溶剂的制备

取三氯化铁适量，用超纯水稀释制成含三氯化铁0.1 mg·mL－1的溶液，作为溶剂。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取依地酸二钠适量，用超纯水稀释制成含依地酸二钠100 μg·mL－1的溶液作为对照品储备溶液。精密量取对照品储备溶液适量，用溶剂稀释制成含依地酸二钠5 μg·mL－1的溶液，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密量取供试品1 mL，用溶剂稀释至100 mL，作为供试品溶液。

3 结果

3.1 专属性试验

精密量取不含依地酸二钠的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶剂稀释至100 mL，得阴性样品溶液。取空白溶液（溶剂）、对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样，结果空白溶液及阴性样品溶液对依地酸二钠测定无干扰，依地酸二钠峰形良好，见图1。

图1 克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of disodium edetate in clindamycin phosphate injection

3.2 检测限和定量限考察

取对照品溶液适量，用溶剂稀释成含不同浓度依地酸二钠的溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，当信噪比（S/N）＝3 时，依地酸二钠浓度为0.03 μg·mL－1，为检测限；当S/N＝10 时，依地酸二钠浓度为0.10 μg·mL－1，为定量限。

3.3 线性关系考察

精密量取对照品储备溶液适量，用溶剂稀释制成含依地酸二钠0.10、0.50、1.01、3.02、5.04、6.05 μg·mL－1的系列标准溶液，分别进样，以依地酸二钠浓度为横坐标，以对应峰面积为纵坐标，按最小二乘法计算线性回归方程，即Y＝2.60×104X－1.32×103，r＝0.998，结果说明依地酸二钠在0.10 ～6.05 μg·mL－1内与峰面积线性关系良好。

3.4 精密度试验

取“2.3”项下对照品溶液，重复进样6 次，依地酸二钠峰面积RSD为0.27%，说明仪器精密度良好。

3.5 重复性试验

精密量取供试品（批号：20063021）1 mL，用溶剂稀释至100 mL，作为供试品溶液，平行制备6 份，进样测定，按外标法以峰面积计算，供试品中依地酸二钠含量的平均值为0.49 mg·mL－1，RSD为0.21%，说明本方法具有良好的重复性。

3.6 溶液稳定性试验

取“2.3”项下对照品溶液和“2.4”项下供试品（批号：20063021）溶液，在室温条件下保存，分别于0、4、8、16、24、48 h 进样测定，记录色谱图中依地酸二钠峰面积，结果对照品溶液中依地酸二钠峰面积RSD为1.2%，供试品溶液中依地酸二钠峰面积RSD为0.77%，表明对照品溶液和供试品溶液在室温条件下48 h 内稳定。

3.7 回收试验

以依地酸二钠理论浓度为基准100%，精密量取“2.3”项下对照品储备液1、5、6 mL 分别置于100 mL 量瓶中，再分别加入不含依地酸二钠的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为20%、100%和120%的回收试验溶液，各浓度平行配制3 份。精密量取上述回收率溶液，进样测定，计算回收率。依地酸二钠的回收率在98.4%～101.5%内（n＝3），RSD为0.71%，表明本方法的回收率良好。

3.8 影响因素试验

对克林霉素磷酸酯注射液（批号：20063021）和按处方自制的克林霉素磷酸酯注射液（批号：DP6232）开展影响因素试验，除去注射液的外包装以及标签，考察高温（60℃）和光照（光源强度5500 lux、近紫外灯能量85 μW·cm－2）对依地酸二钠含量的影响。精密量取供试品1 mL，用溶剂稀释至100 mL，作为影响因素试验的供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样，计算依地酸二钠的含量，结果见表1。

表1 不同考察条件下样品中依地酸二钠含量测定结果Tab 1 Content determination of disodium edetate under different investigation conditions

4 讨论

4.1 溶剂的选择

依地酸二钠易与金属元素螯合，直接进样依地酸二钠时受色谱系统中金属元素的影响主峰拖尾严重[6]。为改善主峰峰形，可先使依地酸二钠与Fe3＋或Cu2＋离子形成稳定的螯合物，再注入液相色谱系统。EDTA-Fe 螯合物与EDTA-Cu 螯合物相比，稳定性更强，且所得色谱峰峰形更好，以EDTA-Fe 螯合物的形式检测依地酸二钠含量的方法更为常见[7-9]。当溶剂中三氯化铁质量浓度为0.1 mg·mL－1（摩尔浓度为0.6 mmol·L－1），可保证对照品溶液和供试品溶液中5 μg·mL－1的依地酸二钠（摩尔浓度为0.015 mmol·L－1）全部转化为螯合物。

4.2 耐用性讨论

当流动相A 的pH 值为3.3 ～3.7，柱温为25 ～35 ℃，流速为0.8 ～1.2 mL·min－1，依地酸二钠峰形无明显变化，且苯甲醇、克林霉素磷酸酯及其有关物质对依地酸二钠检测无干扰，含量检测结果与拟订的色谱条件一致，说明本方法具有良好的耐用性。待依地酸二钠出峰后，流动相中有机相比例逐渐升高至80%，确保供试品溶液中所有组分均被洗脱出色谱系统，防止残留在色谱柱中影响后续样品检测。

4.3 影响因素试验结果讨论

辉瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠的初始含量均为0.5 mg·mL－1，与处方量一致，换算成百分浓度为0.05%，在静脉给药输液中的参考用量0.01%～0.075%[10]。高温条件下，依地酸二钠含量均无变化，预测在规定的贮藏条件下（遮光、密闭、阴凉），辉瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量均不会发生改变。光照条件下，依地酸二钠含量均有所下降，但自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量降低速度更快。有文献报道了元素杂质在光照条件下催化依地酸二钠降解[11-12]，因此推测自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量降低速度更快与自制药液中元素杂质的含量更高有关，有待进一步证实。

本文建立的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二钠含量检测方法方法学验证表明该方法具有较好的专属性、重复性、准确性等，同时该方法操作简便，适用于实验室的日常放行检测。