高效液相色谱法测定头孢拉定胶囊有关物质及方法学验证

杜玮炜（1. 广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，广州 510515；2. 广东省化学药原料与制剂关键技术研究企业重点实验室，广州 510515）

头孢拉定（cefradine，Velosef）是由百时美施贵宝公司于1972年研究成功的第一代半合成头孢类抗菌药物。其适应证为用于敏感菌导致的各种呼吸道、泌尿生殖道及皮肤软组织感染等。除注射剂外，头孢拉定可制成多种口服制剂，包括头孢拉定干混悬剂、头孢拉定片、头孢拉定胶囊和头孢拉定颗粒。

头孢拉定原料有关物质HPLC 检查方法收载于《中国药典》2020年版[1]，其有关物质检验方法的色谱条件与含量测定方法（同时测定头孢氨苄含量）相同，以水-甲醇-3.86%醋酸钠溶液-4%醋酸溶液（1564∶400∶30∶6）为流动相等度洗脱各杂质。2020年版《中国药典》中头孢拉定的各种制剂产品要么没有设置有关物质检查项（头孢拉定干混悬剂和头孢拉定颗粒），要么采用和原料相同的色谱条件进行杂质检验（头孢拉定胶囊、头孢拉定片和注射用头孢拉定）。然而《中国药典》方法具有一定的局限性：对弱保留的杂质分离效果较差[2-3]。起始原料7-ADCA 峰和二氢苯甘氨酸（杂质B）峰与溶剂峰保留时间相近（见图1 和图2）；其他主要降解杂质杂质C、D、E 均在3 ～5 min 内出峰（见图3）。并且按照《中国药典》方法，除头孢氨苄峰和头孢拉定主峰外，起始原料7-ADCA 作为已知杂质按照外标法定量，而最大的另一个工艺杂质——4'，5'-二氢头孢拉定峰被认为是其他单杂，在头孢拉定胶囊中按照2.5%的限度控制，其他重要的能够体现制剂产品质量的降解产物（杂质C、D、E）反而不能得到有效的控制。

图1 《中国药典》有关物质测定方法溶剂色谱图Fig 1 Chromatogram of solvent by ChP method

图2 《中国药典》方法杂质混合对照品溶液色谱图Fig 2 Chromatogram of mixed impurity standards by ChP method

图3 《中国药典》方法供试品溶液色谱图Fig 3 Chromatogram of sample by ChP method

为解决上述问题，本研究参考英国药典[4]对方法进行了研究和改进，建立了方便、准确、专属性强及灵敏度高的头孢拉定胶囊有关物质HPLC 测定法并对其进行了方法学验证。

1 仪器与试药

安捷伦1260 高效液相色谱仪（DAD 检测器，Agilent 公司），戴安U-3000 高效液相色谱仪（DAD 检测器，Thermo Fisher 公司），CPA225D十万分之一电子天平（Sartorius 公司）。头孢拉定胶囊（施贵宝、英国KENT），头孢拉定（批号：130427-201107，纯度：88.3%）、杂质A（7-ADCA，批号：130416-201006，纯度：98.5%）（对照品，中国食品药品检定研究院），杂质B（二氢苯甘氨酸，EP，批号：3.0，纯度：100%）；杂质C（批号：PILD0701-C01，纯度：96.84%）、杂质D（批号：PILD0607-D01，纯度：96.84%）、4'，5'-二氢头孢拉定（批号：PILD1226-EQ01，纯度：98.75%）（对照品，广州牌牌生物科技有限公司）；杂质E（深圳卓越生物科技有限公司，批号：PILD0419-E08，纯度：98.24%）；杂质F（批号：1534-079A3，纯度：100%）、杂质G（批号：2144-023A2，纯度：99.8%）（美国TLC），甲醇（色谱纯，美国Merck公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法及结果

2.1 色谱条件

色谱柱：费罗门Luna 5u C18（2）100A（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；流动相：以2.72 g·L－1磷酸二氢钾溶液（用稀磷酸调pH 至3.0）为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1 进行线性梯度洗脱；流速：1.0 mL·min－1。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution program of mobile phase

2.2 系统适用性

取头孢拉定对照品和头孢氨苄对照品适量，用流动相A 溶解并稀释制成每1 mL 中约各含0.12 mg 的溶液，取25 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢氨苄峰与头孢拉定峰间的分离度为6.7（不得低于4.0），符合系统适用性要求，见图4。

图4 系统适用性色谱图（220 nm）Fig 4 Chromatogram of system suitability（220 nm）

2.3 供试品溶液的配制

取头孢拉定胶囊内容物，精密称取适量，加流动相A 溶解并定量稀释制成每1 mL 中含6 mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 对照溶液的配制

精密量取供试品溶液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，用流动相A 稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（1%自身对照）。

2.5 测定法

分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各25 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。相对保留时间（以下简称RRT）为0.52 的峰为杂质C；RRT为0.62 的峰为杂质D；RRT 为0.80 的峰为杂质E；RRT 为1.06 的峰为4'，5'-二氢头孢拉定。杂质C、D、E 及4'，5'-二氢头孢拉定按自身对照法计算含量。

3 方法学验证

3.1 专属性

3.1.1 强制破坏试验 空白溶剂及各辅料对有关物质测定不会造成干扰。样品在酸、碱、氧化、光照、高温等条件下破坏得到的杂质峰均与头孢拉定峰的分离度符合要求（不低于1.5），降解产物峰之间也具有良好的分离度，各破坏条件下主峰纯度因子均大于990。通过比较试验前后总峰面积的变化，物料平衡（A破坏后总峰面积/A破坏前总峰面积×100%）在90%～110%，方法专属性符合要求，结果详见表2。

表2 强制破坏性试验测定结果Tab 2 Determination of forced degradation test

3.1.2 杂质对照品外加法 取杂质A、B、C、D、E、4'，5'-二氢头孢拉定、杂质F 及杂质G 适量，分别溶解于流动相A 后加至供试品溶液中，精密量取25 μL，注入液相色谱仪，已知杂质无干扰（见图5）。

图5 杂质混合对照品外加溶液色谱图（220 nm 波长）Fig 5 Chromatogram of mixed impurity standards added in sample solution（220 nm）

3.2 线性关系及检测限和定量限

通过配制6 份系列浓度梯度的标准溶液对本方法的线性和范围进行验证。以各杂质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。将杂质对照品溶液稀释至相应的浓度，根据信噪比10∶1，计算得各杂质的定量限；信噪比3∶1，计算得各杂质的检测限。结果表明杂质A ～G、4'，5'-二氢头孢拉定及头孢拉定在相应范围内线性符合要求，方法灵敏度符合要求。

表3 杂质线性方程、检测限和定量限结果Tab 3 Regression equation，LOD and LOQ of impurities

3.3 准确度、精密度及耐用性试验

通过杂质对照品加样回收试验计算方法准确度；结合重复性和中间精密度判断方法精密度；改变柱温、流速、检测波长、流动相pH 对方法耐用性进行验证，结果见表4 ～5，表明该方法适用于头孢拉定胶囊有关物质检测。

表4 验证项目测定结果Tab 4 Determination of validation

表5 耐用性试验结果Tab 5 Durability test

3.4 样品测定

取国内外上市头孢拉定胶囊样品5 批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，采用“2.1”项下色谱条件测定有关物质，结果见表6。在5 批头孢拉定胶囊制剂中均未检出杂质A、杂质B、杂质F 和杂质G，除去工艺杂质4'，5'-二氢头孢拉定外，最大单杂均为杂质E。国内地产化原研产品（施贵宝）的有关物质略好于国外上市（英国KENT）的同品种制剂。

表6 头孢拉定胶囊有关物质测定结果(%)Tab 6 Determination of related substances in samples (%)

4 讨论

《中国药典》采用外标法控制杂质A（7-ADCA）不得过1.0%，而杂质A（7-ADCA）在国内上市的390 批次头孢拉定胶囊[2]和国内外上市制剂（施贵宝、英国KENT）以及强制破坏样品中均未检出。较为复杂的外标法操作显得必要性不强，并且药典对杂质A（7-ADCA）规定标准过高，需要进行适当的降低。

4'，5'-二氢头孢拉定是头孢拉定合成的工艺产物（还原产物），其含量稳定，不会随着稳定性留样过程而增加。英国药典中4'，5'-二氢头孢拉定用含量测定方法测定（检测波长254 nm），限度定为2.0%（外加校正因子1.6），并将4'，5'-二氢头孢拉定、头孢氨苄和头孢拉定一起作为活性成分计入含量。虽然《中国药典》的色谱条件和英国药典不同，但有关物质的检测波长也是254 nm，从理论上判断，两种方法中4'，5'-二氢头孢拉定的校正因子应相当，《中国药典》中有关物质单个杂质2.5%的限度算上校正因子其实为4.0%，显著高于英国药典的这一限度。在全国范围内选择9 个代表性头孢拉定制剂生产地区，从中随机抽取20 批头孢拉定胶囊（每个地区1 ～4批），有关物质最大单杂为1.2%～1.7%[5]，显著小于《中国药典》中有关物质单个杂质2.5%的限度要求，进一步说明药典规定标准过高。而本研究提供的方法，用220 nm 检测4'，5'-二氢头孢拉定，校正因子经计算在0.9 ～1.1（1.03），适合用自身对照法定量。

除头孢菌素外（头孢拉定、头孢氨苄、4'，5'-二氢头孢拉定），杂质C、杂质D 和杂质E 的含量较大（其降解见图6 ～7），且随稳定性放样时间的延长及稳定性放样温度的升高而增长，其含量可反映头孢拉定降解水平，有必要对其进行限量规定。

图6 杂质C、D 降解机制图Fig 6 Degradation mechanisms of impurity C and impurity D

图7 杂质E 降解机制图Fig 7 Degradation mechanisms of impurity E

综上所述，《中国药典》标准中头孢拉定有关物质方法杂质分离效果不佳，单杂限度过高，且对反映头孢拉定胶囊降解水平的杂质C、杂质D和杂质E 无法控制。本研究建立的头孢拉定胶囊有关物质分析方法，能更有效的分离出各杂质，且简单、灵敏，专属性高，适用于头孢拉定胶囊有关物质的测定。