阿胶强骨口服液对大鼠缺铁性贫血的改善及其对铁代谢的调节作用机制初探

恰木斯亚·吐尔逊哈里，美拉依·吉恩斯，武嘉林，2*（. 新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 8300；2.新疆华世丹药业股份有限公司，乌鲁木齐 8300）

贫血影响着全球大约30%的人们的健康，其中有50%是由缺铁引起的[1]。缺铁性贫血（IDA）是由于铁摄入不足、吸收不良、转运受损、利用障碍等原因引起的机体铁缺乏，导致人体血液中红细胞生成减少而引起的贫血，在经济不发达地区的婴幼儿、育龄妇女中多发[2]。口服铁剂是最常见的治疗缺铁性贫血的手段，但近几年报道口服铁剂不良反应较多，例如水溶性差、生物利用率低，导致过量的游离铁进入体内，刺激胃肠道引起恶心、呕吐、腹部不适等，且过量补铁造成铁超载的同时会引发肝脏、心血管的损伤和神经退行性病变[3]。因此近年来毒副作用较低、作用温和、多成分的中药补铁剂在临床应用中凸显其优势。

阿胶强骨口服液是由熟地、阿胶、黄芪等中药组成，依据传统中医学理论，具有补益肝肾、填精壮骨、生血扶正等功效。前期研究[4-6]发现其对贫血有一定疗效，以往研究多集中在阿胶强骨口服液的含量测定、质量标准研究等方面，未见其对缺铁性贫血及铁代谢影响的研究。本实验拟研究阿胶强骨口服液对大鼠缺血性贫血的改善作用并初步探讨其对铁代谢的调节作用，为阿胶强骨口服液应用于临床治疗缺铁性贫血提供实验依据。

1 材料

1.1 试药

阿胶强骨口服液（新疆华世丹药业股份有限公司，规格：10 mL/支，批号：2019111802）；硫酸亚铁（山西力玖药业有限公司，批号：180319）；复方阿胶浆（山东东阿阿胶股份有限公司，批号：1806027）；低铁饲料（睿迪生物科技深圳有限公司，批号：18073112，含铁量6.7 mg·kg－1）；膜铁转运蛋白（FPN-1）酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：20200517）；二价金属转运蛋白（DMT-1）酶联免疫试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：20210518）。

1.2 动物

SPF 级健康雄性SD 大鼠60 只，体质量180 ～200 g [新疆医科大学实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002]，饲养于新疆医科大学动物中心SPF 级屏障环境，维持室温在（24±2）℃，湿度 50%～60%，采用12 h 昼夜节律 7：00 ～19：00 饲养。

1.3 仪器

分析天平（FA104，上海恒平科学仪器有限公司）；ABM 型小动物麻醉机（异氟醚，上海玉研科学仪器有限公司）；全自动生化分析仪（750型，日本光学株式会社）；酶标仪（Model 680，美国伯乐公司）；台式冷冻高速离心机（5417R，德国EPPENDORF 公司）。

2 方法

2.1 IDA 大鼠模型的建立

60 只雄性SD 大鼠适应性喂养5 d 后，随机分为正常对照组（8 只）和造模组（52 只）。根据文献[7]方法加以改进，模型组饲喂低铁饲料、饮用去离子水，每隔3 d 耳缘静脉放血1 mL。依据查阅的相关研究及临床鉴定标准，血红蛋白（HGB）＜90 g·L－1，符合轻度缺铁性贫血判断标准，表明造模成功。正常对照组投喂正常饲料并给予自来水，每周称重并记录体质量。造模28 d 后采血进行分析，检测实验大鼠HGB。

2.2 分组与给药

2.2.1 动物分组 造模过程中死亡4 只，造模成功的模型大鼠随机分为6 组：模型对照组，硫酸亚铁组（阳性药物组），复方阿胶浆组，低、中、高剂量阿胶强骨组，每组8 只。

2.2.2 给药

① 硫酸亚铁组：灌胃硫酸亚铁混悬液5 mL·kg－1及去离子水10 mL·kg－1（临床用量：成人每日3 片，规格：含铁60 mg/片，按动物与人体质量比折算，以成人60 kg 计，大鼠的等效剂量为5 mL·kg－1）。

② 复方阿胶浆组：6.3 mL·kg－1灌胃给药（临床用量：每日20 mL/支，按动物与人体体质量比折算，以成人60 kg 计，大鼠的等效剂量为6.3 mL·kg－1）。

③ 阿胶强骨口服液组：低、中、高剂量分别为3.15、6.3、12.6 mL·kg－1灌胃给药（临床用量：每支10 mL，每日3 支；按动物与人体体质量比计算，以成人60 kg 计，大鼠的等效剂量为3.15 mL·kg－1设为低剂量，中剂量为2 倍即6.3 mL·kg－1，高剂量为4 倍即12.6 mL·kg－1）。

造模完成后，各给药组均连续灌胃28 d，每隔3 d 称体质量，并拍照观察状态。灌胃给药期间各药物组、模型对照组饲喂低铁饲料，防止外源性铁的摄入，正常对照组则给予正常饲料。

2.3 指标检测

2.3.1 大鼠体质量及脏器系数测定 各组动物末次给药后，禁食12h，称重记录末次体质量。完成取血后，脱颈椎处死大鼠，并解剖剥离心脏、肝脏、脾脏，并称量各脏器质量。脏器系数即为各脏器质量/大鼠体质量。

2.3.2 血常规检测 造模28 d 后所有大鼠眼眶取血置含抗凝剂 EDTA-2K 的EP 管中，用于血常规分析。各组动物末次给药后，禁食12 h。大鼠麻醉后颈动脉取血1 mL 置含抗凝剂 EDTA-2K 的EP管中，用于血常规分析。

2.3.3 血生化检测 采集的血液放置在37 ℃培养箱1 h，冰箱4℃过夜，3000 r·min－1离心20 min，吸取上清液，测定血清铁（SI）。

2.3.4 铁代谢相关蛋白检测 采用ELISA 法检测大鼠DMT-1、FPN-1。取各组大鼠十二指肠同一部位，切割标本后，称取质量。加入一定量的PBS 后用手动匀浆器匀浆，充分离心后收集上清液。严格按照试剂盒操作步骤进行检测，计算出各给药组蛋白含量。

2.4 统计学方法

数据使用 SPSS 21.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较用SNK 法；多组不符合正态性比较采用秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠体质量及脏器指数的影响

大鼠体质量及各脏器指数如表1 所示，模型对照组大鼠体质量较正常对照组显著降低（P＜0.01），各药物组补铁后大鼠体质量回升，但差异无统计学意义。肝脏是最重要的储铁器官之一，而铁主要以铁蛋白和含铁血黄素形式存在于此[8]。与模型对照组比较，补铁后各组大鼠肝脏指数、脾脏指数和心脏指数差异均无统计学意义。

表1 阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠体质量及脏器指数的影响( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

表1 阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠体质量及脏器指数的影响( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

注（Note）：与正常对照组比较，##P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01）。

组别体质量/g肝脏指数/%脾脏指数/%心脏指数/%正常对照组416.00±25.072.67±0.080.19±0.040.33±0.04模型对照组394.70±61.58##2.40±0.230.20±0.040.35±0.06硫酸亚铁组395.20±43.202.26±0.420.23±0.070.32±0.03复方阿胶浆组385.60±43.202.21±0.210.23±0.040.32±0.04阿胶强骨口服液低剂量组408.90±30.572.33±0.310.24±0.050.36±0.05阿胶强骨口服液中剂量组407.30±46.282.42±0.270.25±0.060.32±0.04阿胶强骨口服液高剂量组409.90±43.862.37±0.340.24±0.040.36±0.05

3.2 阿胶强骨口服液对大鼠血常规的影响

造模28 d 后进行血常规检测，结果如图1 所示。与正常对照组比较，模型对照组大鼠HGB下降[（179.00±8.60）vs（78.29±8.60）g·L－1，P＜0.05]。依据临床鉴定标准，HGB 低于90 g·L－1，符合轻度缺铁性贫血模型评价标准[9-15]。且模型对照组较正常对照组红细胞数（RBC）、红细胞比容（HCT）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞平均体积（MCV）差异均有统计学意义（P＜0.05），说明造模成功。

图1 大鼠造模完成时血常规变化Fig 1 Blood routine indicators at the completion of modeling in rats

药物干预28 d 后测试各组大鼠血常规指标。由图2 可知，各组HGB 值均不同程度的增加，阿胶强骨口服液低、中、高剂量组较模型对照组HGB（91.0±6.98）g·L－1分别增加到（127.8±7.33）、（131.0±9.67）、（131.4±8.33）g·L－1；HCT 较模型对照组（26.05±1.64）%分别增加到（32.78±1.60）%、（35.2±3.73）%、（33.5±2.02）%。HGB 减少是缺铁性贫血的主要表现形式之一[16-17]。临床上红细胞MCH 和MCV下降多见于缺铁性贫血[18]。由图2 可知，在给药期内所有实验组大鼠的MCH 值和MCV 值均明显高于模型对照组（P＜0.05）；且阿胶强骨口服液各剂量组均趋于正常。

图2 阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠血常规影响Fig 2 Effect of Ejiao Qianggu oral solution on blood routine examinationin rats with iron deficiency anemia

3.3 阿胶强骨口服液对大鼠血清铁及DMT-1、FPN-1 蛋白的影响

SI 含量检测结果如图3 所示，与正常对照组比较，模型组SI 含量显著降低；与模型对照组比较，阿胶强骨口服液中、高剂量组SI 显著升高（P＜0.05），提示阿胶强骨口服液能增加SI 含量。

图3 阿胶强骨口服液对大鼠SI 及DMT-1、FPN-1 蛋白的影响Fig 3 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on the serum iron，DMT-1 and FPN-1 proteins in rats

大鼠十二指肠DMT-1、FPN-1 蛋白含量测定结果如图3 所示。DMT-1 蛋白测定中阿胶强骨中、高剂量组较模型对照组显著升高（P＜0.01），提示阿胶强骨口服液显著增强缺铁性贫血大鼠十二指肠DMT-1 蛋白的表达。FPN-1 蛋白测定中阿胶强骨口服液高剂量组与模型对照组显著升高（P＜0.01），提示阿胶强骨口服液高剂量组能显著增强缺铁性贫血大鼠十二指肠FPN-1 蛋白的表达。

4 讨论

4.1 阿胶强骨口服液药理作用分析

HGB 又称血色素，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。HGB 变化的临床意义基本和红细胞计数的临床意义相似，HGB 能更好地反映贫血的程度[19-20]。本实验结果显示阿胶强骨口服液能增加HGB 含量，且效果与阳性药物相当，又能增加HCT、MCH、MCHC、MCV 含量。模型对照组红细胞数较造模完成时略有增加，可能与贫血模型大鼠长期缺氧（HGB 含量低，贫血），机体代偿性增加红细胞数量有关。铁是构成HGB 的一种重要组成部分，为机体的必需微量元素之一，参与机体的生命活动。铁离子的主要转运形式是SI 与转铁蛋白结合[21-23]。阿胶强骨口服液能增加SI 含量且与给药剂量呈线性递增关系。食物中的铁离子主要经肠上皮细胞表达的DMT-1 和FPN-1 进入血液[24]。DMT-1 在各组织中都有分布，但是在近端小肠表达最高[25]。FPN-1 作为跨膜铁输出蛋白，主要在十二指肠绒毛上皮细胞的基底端和基底膜分布，将肠细胞内的铁离子转运出细胞，进入血液[26]。基于此本研究选择了具有代表性的以上两种蛋白，结果阿胶强骨口服液能增加大鼠十二指肠DMT-1 和FPN-1 蛋白含量，推测阿胶强骨口服液通过上调DMT-1 和FPN-1 来促进十二指肠对铁的吸收，增加SI 含量，促进HGB 合成。

4.2 阿胶强骨口服液组方规律分析

阿胶强骨口服液由熟地、阿胶、枸杞、黄芪、党参、牡蛎等组成，依据“气血互生、气升血长”的传统中医学理论加味而成。

君药熟地补血滋阴，益精填髓。研究表明熟地黄内含梓醇、糖类、氨基酸、地黄苷以及多种微量元素，可增强人体免疫力，促进造血。相关药理实验研究显示熟地黄水提物可增加实验鼠骨髓造血干细胞以及祖细胞的增殖分化过程，能够加速增加HGB，加速造血功能恢复[27-28]。

臣药阿胶补血滋阴，润燥，止血。阿胶含有多种氨基酸和微量元素，有增强免疫、促进造血功能、促进骨愈合等作用。现代药理学研究发现阿胶能够治疗贫血，且不影响铁储备[29]。阿胶中的甘氨酸成分可调节SI 以发挥加快血液合成HGB 速度，控制缺铁性贫血[30]。相关临床实践研究证明中药阿胶在刺激机体红细胞与HGB 再生功能方面的疗效远远高于铁剂，故多被应用于血小板减少、白细胞减少症以及缺铁性贫血症[31-32]。本次实验研究也表明阿胶强强骨口服液能显著增加大鼠SI 含量、HGB 含量，与临床上众多学者的研究结果相同[33]。

佐药黄芪补气升阳，生津养血。党参具有健脾益肺、养血生津之功效，用于脾肺气虚、气血不足、面色萎黄、心悸气短等症，具有增强造血功能、调节血压等功效，临床上可用于防治高血脂症、低血压、造血功能障碍[34]。牡蛎重镇安神、潜阳补阴、软坚散结。牡蛎咸寒、敛阴止汗，黄芪性温、补气益损，两者配伍，一补一涩，阴阳兼顾，共俱补虚止汗之功，阴阳气血不足多用此两味。临床对于怀孕妇女及小儿钙质缺乏等有效[35-37]。

传统中医理论认为熟地、阿胶、黄芪、党参四味药配伍具有补血补气、补精填髓的功效，由此推测阿胶强骨口服液中补血生血的药味主要是熟地、阿胶，其次是黄芪与党参。整个组方君臣佐使分明，依据传统中医理论多角度、多靶点治疗贫血，方中各药味协同使用可气血双补。

综上所述，阿胶强骨口服液能有效改善大鼠缺铁性贫血、促进铁代谢，其作用机制与肠道铁转运相关的DMT-1、FPN-1 蛋白密切相关。相对阳性对照（硫酸亚铁补铁组）并未出现不良反应。阿胶强骨口服液中具体何种物质治疗贫血则有待进一步深入研究，本结果有望为开发一种新的治疗缺铁性贫血的药物提供实验依据。