三阴性乳腺癌患者血清中miRNA-21、miRNA-210表达及其临床意义

赵霞

（河南中医药大学第三附属医院，河南郑州 450004）

乳腺癌为全球范围内女性常见的恶性肿瘤，约占所有女性恶性肿瘤的22%，每年全球有50 余万女性死于乳腺癌［1］。三阴性乳腺癌为特殊亚型乳腺癌类型，是指孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）及人表皮生长因子受体2（HER-2）均为阴性的乳腺癌类型，常发于年轻女性，大部分均属基底细胞样乳腺癌，细胞同源性高，组织分化程度差，对内分泌及分子靶向治疗不敏感，预后差，病死率高［2］。在分子及遗传学方面，恶性肿瘤系基因表达调节失衡的结果，其病变过程包括抑癌基因失活及原癌基因激活，而明确三阴性乳腺癌肿瘤细胞异常表达基因，并阻断靶基因表达，则可为其靶向治疗提供指导。miRNA 为真核细胞内分布的微小内源性非编码单链RNA 分子。研究发现，miRNA 对多类肿瘤相关基因表达均存在一定的负调节作用，在恶性肿瘤发病及进展中有重要作用［3］。miRNA-21 是目前研究较多的与肿瘤发生相关的miRNA，在胃癌、肺癌中均可见miRNA-21高表达［4-5］，且体外试验证实，miRNA-21 与癌细胞生长及凋亡均存在密切联系［6］。miRNA-210 则为与食管癌、尿路上皮细胞癌发病密切相关癌基因，位于染色体11p15.5 上，可降低DNA 的修复能力，促进肿瘤新生血管生成［7］。但对miRNA-21、miRNA-210 与三阴性乳腺癌发病的关系尚未明确。基于此，为明确miRNA-21、miRNA-210 在三阴性乳腺癌患者血清中的表达及其临床意义，现对河南中医药大学第三附属医院收治的64 例三阴性乳腺癌患者的临床资料进行回顾性分析，报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集2015 年5 月至2017 年7 月河南中医药大学第三附属医院收治的64 例三阴性乳腺癌患者作为病例组。纳入标准：经病理确诊为三阴性乳腺癌，且符合国际抗癌联盟（UICC）相关分期标准，为Ⅰ～Ⅳ期患者；年龄>18 岁；入组前均未接受任何治疗；病例及随访资料完整。排除标准：入院3 个月内有激素依赖史者；合并其他恶性肿瘤者；合并心、肝、肾肺器质性功能障碍者；合并严重精神疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并全身代谢紊乱者；采集血样前已接受放化疗或靶向治疗者；妊娠或哺乳期女性；病例资料不完整者。患者年龄22～73 岁，平均（42.6±5.7）岁；月经状况：绝经前43 例，绝经后21 例；临床分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期10例。选择同期来医院体检的40 例正常健康女性作为对照组，均经体格检查心肝肾肺功能正常，无乳腺癌家族病史。对照组年龄21～69 岁，平均（41.9±6.3）岁；月经状况：绝经前27 例，绝经后13 例。

1.2 主要材料与仪器

RNA 抽提试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、miRNA cDNA 合成试剂盒（均购自美国Invitrogen 公司），Takara 反转录试剂盒（购自大连宝生物工程公司），引物设计及合成（上海生工生物工程股份有限公司）；7900HT 型荧光定量PCR 仪（购自美国ABI 公司），Allegra X-15R高速冷冻离心机（购自美国Beckman Coulter 公司），-80℃超低温冰箱（购自中国海尔电器公司），紫外分光光度计（购自德国Eppendorf 公司），倒置显微镜（购自日本Olympus 公司）。

1.3 方法

①血清miRNA-21、miRNA-210 测定。病例组入院次日采集外周空腹静脉血6 mL，对照组体检当日采集空腹静脉血6 mL，室温静置，3 500 r/min离心10 min 后分离血清，严格参照RNA 抽提试剂盒使用说明提取血清总RNA，反转录合成cDNA，反转录反应体系：RNA 模板1 μL+5×RT 缓冲液5 μL+dNTP 0.75 μL+RNA 酶抑制剂0.25 μL+反转录酶0.25 μL+去离子水补足至20 μL，反转录条件：16℃30 min，42℃30 min，75℃15 min，获得cDNA 产物；采用RT-PCR 法测定miRNA-21、miRNA-210 表达量，应用RT-PCR 试剂盒进行扩增反应，U6 为内参，上游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGCAT-3'，下游：5'-GGGTGGAATACATTGGAACATGT-3'；miRNA-21上游：5'-GTGCAAGCGAAATTAAGGGA-3'，下游：5'-CTGCACCACCTTTCTTTGGT-3'；miRNA-210 上游：5'-ATTATACAATAG-TGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，下游；5'-TAAAATATTACTGTGCGTGTGACAGC GG-3'；反应体系：cDNA 产物2 μL+miRNA qPCR Mix 10 μL+miRNA-21/miRNA-210 上下游引物各1 μL+双蒸水补足至20 μL，扩增条件：95℃预变性60 s，95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸40 s，共50 个循环，均设2 复孔，获得样品RT-PCR 曲线，获取目的基因循环阈值（Ct 值），血清miRNA-21、miRNA-210 相对表达量参照2-△△Ct进行计算。②临床病理资料收集。均收集所有病例组患者临床病理资料，包括年龄、绝经状况、肿瘤直径、病理分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移等，分析血清miRNA-21、miRNA-210 与三阴性乳腺癌临床病理参数的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件处理数据，计量数据以均数±标准差（）表示，组间比较进行t检验，并以多重线性回归分析miRNA-21、miRNA-210 与三阴性乳腺癌临床病理的关系，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组、对照组血清miRNA-21、miRNA-210 表达比较

病例组血清miRNA-21、miRNA-210 相对表达量均高于对照组，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05），见表1 与图1、2。

2.2 三阴性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210表达与临床病理参数的关系

不同年龄、绝经状态、肿瘤直径三阴性乳腺癌患者miRNA-21、miRNA-210 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05），临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、组织分化程度为低分化、合并淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相对表达量高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织分化程度为中高分化及未合并淋巴结转移者，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表1 病例组、对照组血清miRNA-21、miRNA-210 表达比较 （）

表1 病例组、对照组血清miRNA-21、miRNA-210 表达比较 （）

图1 两组miRNA-21 表达量比较

图2 两组miRNA-210 表达量比较

表2 三阴性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表达与临床病理参数的关系 （）

表2 三阴性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表达与临床病理参数的关系 （）

2.3 miRNA-21、miRNA-210 与临床病理参数关系多元逐步回归分析

纳入单因素分析中有统计学意义数据进入多元逐步回归分析方程，结果显示：miRNA-21、miRNA-210 均为三阴性乳腺癌患者临床分期、组织分化程度、淋巴结转移的影响因素（P<0.05），见表3。

表3 miRNA-21、miRNA-210 与临床病理参数关系多元逐步回归分析

3 讨论

miRNA 为一类内源性、微小型非编码单链RNA 分子，调节多种生物学信号通路，可与靶基因互补点位配对结合，影响靶基因转录，影响miRNA 降解及蛋白质合成［8］。近期研究发现，miRNA 异常表达可能参与任一恶性肿瘤形成过程，包括结肠癌、食管癌、肺癌等［9-10］，低表达miRNA 可能存在一定的抑癌基因作用，而高表达miRNA 则存在癌基因作用，体内miRNA 调节紊乱可能是恶性肿瘤发生的重要机制。三阴性乳腺癌为特殊亚型乳腺癌，发病年龄年轻，且恶性程度高，组织分化程度低，大部分临床分期较晚，常伴腋窝淋巴结转移，较一般亚型乳腺癌侵袭性高，病情进展速度快，复发及远处转移率明显高于其他类型乳腺癌［11］。且对化疗、内分泌治疗及靶向治疗敏感度低，预后差。目前尚未完全明确三阴性乳腺癌发病的机制，随着医学分子生物技术的不断发展，研究者逐渐认识到miRNA 在乳腺癌发病中可能存在一定的调控作用［12］。

miRNA-21 定位于17q23.2，位于液泡膜蛋白基因编码区，文献报道，宫颈癌、大肠癌、胰腺癌等多种肿瘤标本及细胞系内均可检出miRNA-21异常高表达，认为miRNA-21 为公认致癌性miRNA，其过度表达可促进肿瘤新生血管生成［13-14］。杨晨等［15］指出，miRNA-21 在肿瘤化疗药物敏感性存在一定的调节作用。细胞药物敏感性试验发现，miRNA-21 表达水平上升可影响抗癌复合物效能［16］。也有学者发现，miRNA-21 表达与恶性肿瘤侵袭性有关，随肿瘤恶性程度的上升，miRNA-21 表达水平上调［17］。本研究采用RT-PCR法测定三阴性乳腺癌与正常健康人血清miRNA-21水平，结果发现，病例组miRNA-21 水平明显高于正常健康人，提示miRNA-21 异常表达可能参与三阴性乳腺癌的发病过程。同时，对miRNA-21 与三阴性乳腺癌临床病理参数的关系进行研究发现，临床分期越晚、组织学分级越低且伴淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者血清miRNA-21 相对表达量越高，提示miRNA-21 异常表达与三阴性乳腺癌生物学行为存在密切联系，高表达miRNA-21 可能参与三阴性乳腺癌癌细胞侵袭、转移过程，且与患者病情进展存在紧密关联。

miRNA-210 则为近年来发现与肿瘤细胞增殖、迁移有关的miRNA，其为细胞缺氧应答的关键分子，参与血管内皮生长因子所介导的细胞侵袭、转移过程［18］。研究发现，miRNA-210 参与乏氧细胞生物学功能调节，持续高表达miRNA-210 可调节缺氧条件下癌细胞线粒体功能，促进乏氧癌细胞生长［19］。ZHU 等［20］表示，miRNA-210 可通过调节纤维母细胞生长因子受体促进肿瘤细胞增殖。也有学者发现，在肝癌细胞内高表达miRNA-210可通过靶向定位乙型肝炎病毒基因促使病毒复制，造成持续性感染［21］。张双鹤等［22］指出，乳腺癌细胞株miRNA-210 过表达与癌细胞乏氧分数有关，miRNA-210 高表达乳腺癌患者预后通常较差。本研究发现，三阴性乳腺癌患者血清miRNA-210 相对表达量明显高于正常健康人，且进行病理参数监测发现，miRNA-210 表达受三阴性乳腺癌病理分期、组织分化程度及淋巴结转移的影响，提示miRNA-210 在三阴性乳腺癌血管形成、癌细胞存活、DNA 修复等过程均发挥一定的作用，同时可诱导乳腺癌细胞侵袭、转移，可将其作为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。

综上所述，三阴性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相对表达量明显高于正常健康人，且其表达量受三阴性乳腺癌临床分期、组织学分级及淋巴结转移的影响，临床分期越晚、组织分化程度越低且伴淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 表达水平越高。