针刀干预对膝骨关节炎兔韧带组织中TGF-β1/Smads信号通路的影响*

李佳茹，曹韵茗，杨郁鹏，司佳弘，赵季宇，任华山，金晓飞△，燕 平

(1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.郑州澎青医学高等专科学校，河南 郑州 450064)

膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一种常见的慢性持续性疾病，临床上根据发病原因分为原发性骨关节病和继发性骨关节病[1]，原发性膝骨关节炎的病因目前没有明确的探究与说明，发病人群多以老年人常见，继发性骨关节炎多是在已有的基础上产生新的病理变化所致，由于各种炎症的增生，膝关节内部稳定结构被破坏，出现关节疼痛肿胀等相关症状[2]。有研究发现，膝骨关节炎的发生与膝关节周围韧带损伤有关，膝关节韧带由致密的结缔组织构成，不仅可以控制关节滑动，维持关节稳定，还可以保持关节面的生理压力，减少摩擦，起到保护关节软骨作用[3]。本研究基于TGF-β1/Smads信号通路，以针刀刺激与电针“内膝眼”“外膝眼”等作为对照，观察KOA兔韧带组织中TGF-β1、Smad4、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9，MMP-9)mRNA及蛋白表达的影响，阐述针刀干预对KOA兔的作用机制及对韧带组织形态结构的影响，进一步探讨其作用与TGF-β1/Smads信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

日本大耳白兔32只，SPF级，雌雄各半，体质量(2.25±0.1)kg。由北京市昌扬西山养殖场提供[许可证号：SCXK-(京)2016-0007]，适应性喂养7 d后随机分为空白组、模型组、电针组和针刀组，每组8只。除空白组外，其余3组均造模。本研究经山西中医药大学动物实验伦理审查批准。

1.2 主要试剂及仪器

BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；一次性无菌针刀、针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司)；Smad4一抗(爱博泰克生物科技有限公司)；TGF-β1一抗(武汉博士德生物工程有限公司)；MMP-9一抗(武汉博士德生物工程有限公司)；显微镜(日本尼康株式会社)；凝胶成像分析仪(U-niversal HoodⅡ Bio-rad)；Tanon5200全自动化学发光成像分析系统(上海天能生物科技有限公司)；移液器(美国Thermo公司)；荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)等。

1.3 KOA兔造模及干预措施

根据文献[4]，采用改良的Videman法即左后肢伸直位固定制动法造模，除空白组外，其余3组实验兔左下肢用石膏绷带固定6周，结束后取各组膝关节软骨组织作病理观察，显示造模成功后进行治疗。1周后，空白组和模型组不做干预；电针组取穴参照《实验针灸学》兔腧穴定位[5]选取阴陵泉、阳陵泉、内膝眼和外膝眼，选用0.18 mm×25 mm毫针直刺0.3 cm，以华佗牌电子针治疗仪，分别连接阴陵泉和阳陵泉，内膝眼和外膝眼。波形疏密波，频率2/100 Hz，强度3 mA，每次20 min，以局部肌肉开始轻度抖动、KOA兔不挣扎为度，隔日治疗1次，1周治疗3次，共治疗3周；针刀组在兔膝关节针刀进针部位，选用一次性无菌针刀，规格0.35 mm×30 mm，以龙胆紫定位，常规备皮、消毒，然后刺入针刀，出针并按压片刻止血，每周1次，共3次，进针点操作：针刀于内、外韧带中点前缘进针，刀口线与韧带平行，刀体与皮肤切面垂直刺入，向韧带起止点方向分别松解，出刀并加压片刻。

1.4 指标检测

1.4.1 组织形态观察 各组兔用10%的水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，取左侧膝关节外侧中断韧带组织，切成0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm小块，立即放置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA 脱钙完全后修切并进行常规石蜡包埋，5 μm厚度连续切片，HE染色后光镜下观察。

1.4.2 关节腔内状态观察 打开兔膝关节腔，肉眼大体观察各组兔膝关节的滑膜、周围韧带、肌肉-肌腱和关节囊等大体形态表现。由两位观察者参照JessicaBadendick评分系统[6]对各组兔大体形态进行评分，要求两名评分人员同时对样本进行评估并各自打分，结果取两者平均值，两次评估人员相同。见表1。

表1 JessicaBadendick大体形态评分标准

1.4.3 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测关节韧带组织mRNA含量 分别提取各组兔膝关节韧带组织RNA，反转录成cDNA单链为模板，采用25 μLPCR反应体系：各基因对应上下游引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，cDNA模板2.0 μL,灭菌双蒸水8.5 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35个循环；65 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，预变性95 ℃ 1 min，循环(40次)，95 ℃ 15 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s末段延伸，72 ℃ 5 min，溶解曲线，72 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃选取GAPDH为内参基因。采用2-△△CT表示各基因的相对表达量。见表2。

表2 引物序列

1.4.4 免疫印迹法(Western Blot，WB)法检测关节韧带组织蛋白含量 将冻存于-80 ℃冰箱的韧带组织取出备用，使用RIPA裂解液将细胞裂解，按说明书步骤配制总蛋白溶液，置于组织匀浆器中，12 000 rpm离心5 min，取上清，使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。取总蛋白上样，电泳，切胶，转至PVDF膜上，使用5%的脱脂牛奶封闭1 h，加入TGF-β1一抗(1∶1 000)、Smad4一抗(1∶1 000)、MMP-9一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜，加二抗(1∶5 000)，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜，ECL发光试剂盒显色、显影，以GAPDH为内参蛋白，用Image J软件分析各条带的灰度值，采用目标蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值来表示目的蛋白相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 韧带组织形态学观察

HE染色结果显示：空白组膝关节韧带组织结构完整，韧带细胞数目多，排列整齐；模型组韧带组织结构层次不清，韧带层薄而粗糙，韧带细胞数目少，排列散乱；电针组与模型组比较，韧带组织结构层次清楚，韧带细胞增多，但局部细胞排列散乱；针刀组与模型组比较韧带组织结构完整，韧带细胞较多，排列整齐，但不及空白组。见图1。

图1 各组兔膝关节韧带HE染色情况(200×)

2.2 关节腔内状态观察

JessicaBadendick评分结果显示：与空白组比较，模型组关节腔软骨形态评分显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，电针组、针刀组关节腔软骨形态评分降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与电针组比较，针刀组评分较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组JessicaBadendick评分比较

2.3 各组KOA兔韧带TGF-β1、Smad4及MMP-9 mRNA 表达的影响

与空白组比较，模型组兔韧带组织中TGF-β1、Smad4 mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，MMP-9 mRNA表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，电针组、针刀组TGF-β1、Smad4 mRNA表达较模型组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，MMP-9 mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；针刀组与电针组比较，TGF-β1 mRNA表达较高，MMP-9表达较低，差异有统计学意义(P<0.05)，Smad4表达差异无统计学意义(P>0.05)，各引物扩增曲线均正常，溶解曲线均单峰，见表4、图2。

图2 引物验证

表4 各组兔韧带TGF-β1、Smad4和MMP-9 mRNA比较

2.4 各组KOA兔韧带TGF-β1、Smad4及MMP-9蛋白表达的比较

与空白组比较，模型组兔韧带组织中 TGF-β1、Smad4蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，MMP-9蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，电针组、针刀组TGF-β1、Smad4蛋白表达较模型组均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，MMP-9蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；针刀组与电针组比较TGF-β1蛋白表达较高，MMP-9蛋白表达较低，差异具有统计学意义(P<0.05)，Smad4蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表5。

表5 各组兔韧带TGF-β1、Smad4和MMP-9蛋白比较

图3 各组TGF-β1、Smad4及MMP-9的Western Blot检测结果

3 讨论

中医学理论认为KOA形成的内部原因主要与肝、肾相关，肝肾阴阳失调、气血亏虚，正气不足、邪气内生而引起骨性病变，外因可受风寒湿热等邪气导致瘀血内阻、筋脉不通和筋失濡养而致，临床治疗时多以补肝肾调气血为主。但KOA的病因与发病机制较为复杂，需要不断的探索与研究，从韧带分子生物学来看，其病理学特征是韧带及周围软组织粘连损伤、挛缩等导致膝关节无法发挥正常的生理活动。前期研究结果显示，针刀干预对KOA韧带生物力学有影响[7]，调控该力学特性的分子生物学机制还需要进一步的实验来论证。本实验在分子生物学理论的基础上进一步探究针刀治疗KOA的作用效应，其针刀的干预优势是对膝关节周围韧带组织进行松解，抑制外源性愈合所导致的粘连，消除内源性愈合的不利因素[8]，达到治愈的目的。其中，TGF-β1/Smads信号转导通路在内源性愈合和外源性愈合起着非常重要的作用。

TGF-β1作为转化生长因子，在细胞增殖分化、凋亡、粘连和迁移等多个细胞过程中发挥重要作用，它还是重要的致纤维化的细胞因子，有调节细胞生长分化、组织修复、参与炎症和免疫等作用[9-10]。Smad4在信号传输途径中处于中枢地位, 是唯一的共同介导型Smad[11]，Smad4蛋白的异常表达可引发TGF-β1蛋白表达的减少，导致周围韧带及软组织的粘连[12]。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族，作为TGF-β1/Smads信号通路的重要下游分子，过度表达会造成韧带组织的破坏进而导致KOA的发生。有研究发现[13]，当阻断TGF-β1/Smads信号通路在细胞核内的传递作用，其能够刺激细胞外基质蛋白的产生，可以增加MMPs抑制剂的产生，阻止细胞外基质蛋白的降解，防止周围组织粘连而产生瘢痕[14]，因此，可以通过抑制MMP-9的活性，促进胶原及蛋白多糖等基质合成，缓解软骨退变，同时减少周围组织粘连的增生，促进膝骨关节炎愈合。

针刀是朱汉章教授根据多年的临床经验将传统针具与现代医疗刀具结合的产物，在治疗膝骨关节炎等方面发挥了重要的作用，针刀医学理论认为[15-16]，针刀通过刺激病变的经筋，松解周围组织的粘连，使挛缩筋结的部分疏通，改善周围软组织的炎性病变，调节髌骨周围产生的压力及髌韧带、交叉韧带等力学平衡，加强筋肉的生理调节作用，恢复骨关节内环境的动态平衡，阻断膝骨关节疾病的进一步发展。本实验通过研究针刀及电针干预下治疗膝骨关节炎，对兔膝关节韧带组织HE染色发现，模型组膝关节韧带的破坏程度最为严重，治疗组经针刀及电针治疗后略有改善，既可证明造模成功，又提示针刀及电针治疗的有效性，造模后膝关节韧带组织TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白表达减弱，MMP-9 mRNA和蛋白表达增强，韧带组织有所损坏，造成膝关节炎的产生。针刀、电针干预可以进一步激活TGF-β1/Smad4信号通路，抑制MMP-9 mRNA和蛋白表达，从而促进韧带功能的修复，且针刀的干预效果较优于电针干预。本实验结果提示，针刀干预通过调节TGF-β1/Smads信号通路的表达，可以促进关节韧带的修复，减轻关节韧带损伤。

综上所述，针刀及电针通过对TGF-β1/Smads通路发挥调控作用，表明该治疗手段可以间接抑制韧带组织被破坏，通过调节TGF-β1、Smd4和MMP-9的分泌以保护受损的韧带组织，进而缓解病情进展，改善预后。但还需要进一步扩大样本量研究该治疗手段对KOA的改善情况，可在细胞层面上探究针刀对KOA在其他相关信号通路中的影响作用，为针刀应用于临床治疗骨关节炎提供更具体的理论基础与科学依据。