凝结芽孢杆菌发酵复方中药工艺研究

柴保国，陈佩格，韩 露，高贵超，崔俊亚，李登云

（1.河南牧翔动物药业有限公司，河南 郑州 450000；2.河南省畜牧总站）

黄芪、防风和白术是常用的中医药材，这三味药组成又称玉屏风散，是治疗气虚感冒的代表方剂。黄芪能够调节血压、增强免疫功能，白术能够健脾胃，降血糖，而防风有消炎镇痛等作用，防风配合着黄芪、白术，能够健脾去湿，对于疾病有防范作用，同时还能够治疗感冒。绞股蓝又名七叶胆，五叶参，具有降血脂，调血压，防治血栓，防治心血管疾患，调节血糖，促睡眠，缓衰老，抗癌，提高免疫力等特点。

中药发酵是指在微生态学理论指导下，将中药研究与微生物发酵技术相结合，利用微生物强大的代谢和繁殖能力，以中草药物或提取物（液）为基质使有机物分解的生物转化反应过程。在中药发酵过程中，菌种的选育是中药发酵的关键。目前在多数实验研究中，多采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌等，但枯草芽孢杆菌对不同的中药发酵效果也有所不同。根据李国红等的实验结果，在经枯草芽孢杆菌发酵后，部分中药的发酵产物抗菌活性增加，而部分中药的发酵产物抗菌活性却有所降低。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，具备高抗逆性、强黏附性、分泌消化酶、产抑菌物质、易于培养与贮存稳定等独特优势，现已被农业农村部列为可直接饲用于畜禽生产的新型饲料添加剂。因此，凝结芽孢杆菌是目前畜牧业研究和应用的热点。

1 材料与方法

1.1 药材和菌种

黄芪、白术、防风、绞股蓝购自河北省安国市永益中药材有限公司，经河南省牧翔动物药业有限公司质管部检验为正品。凝结芽孢杆菌（含量为20 亿cfu/g），购自山东康地恩生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物，均购自北京奥博星生物科技有限公司；人参皂苷Rb1，购自中国药品生物制品检定所；淀粉和玉米粉购自农贸市场；硫酸铵，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.3 凝结芽孢杆菌的复苏与培养

将保存的凝结芽孢杆菌菌种接种到种子斜面培养基，活化培养。取活化的菌种接种到50 mL（250 mL 三角瓶）营养肉汤培养基中，37 ℃，180r／min，培养24 h后备用。

1.4 复方中药发酵条件优化

采用单向透气阀袋固体发酵方法对复方中药黄芪、白术、防风、绞股蓝进行发酵，发酵室温度控制在30 ℃，湿度≤50%，考察不同碳源、氮源及发酵时间对发酵进程的影响。

1.4.1 最佳发酵碳源筛选

凝结芽孢杆菌可以分解淀粉，因此选择以葡萄糖、淀粉和玉米粉作为备选碳源，考察不同碳源在不同发酵时间对发酵进程的影响。通过测定发酵后凝结芽孢杆菌数量，选择最佳发酵碳源及发酵时间。

1.4.2 最佳发酵氮源筛选

选择以硫酸铵、酵母浸出物及蛋白胨分别作为氮源，考察不同氮源在不同发酵时间对发酵进程的影响。通过测定发酵后凝结芽孢杆菌数量，选择最佳发酵氮源及发酵时间。

1.5 发酵前后有效成分检测

按比例分别称取复方中药和最优发酵体系发酵的复方中药样品100 g，各加10倍量水煎煮40 min，离心取上清液浓缩定容至400 mL，分别进行高效液相色谱法检测绞股蓝皂苷含量变化和紫外分光光度计法检测总多糖含量变化。

早期中立评估(Early Neutral Evaluation，简称ENE)作为一种非诉讼纠纷解决方式，是近年来国际上兴起的一种司法ADR制度。与民间ADR不同，司法ADR又称法院附设ADR，是指以法院为主持机构或者受法院指导，但与诉讼程序截然不同的具有准司法性质的诉讼外纠纷解决程序。〔9〕

分别取适量的发酵前后提取液，加乙醇静置24 h后离心，收集沉淀加适量蒸馏水溶解稀释，然后进行二次醇沉，最后收集沉淀且烘干至恒重后使用蒸馏水溶解稀释，制成样品溶液。以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法，取2 mL样品溶液在490 nm处测定吸收度，计算。

1.6 绞股蓝皂苷含量变化检测

绞股蓝中含有50多种皂苷，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ分别与人参皂苷Rb1、Rb2、Rd、F2 为同一物质，该研究以人参皂苷Rb1为对照品，采用高效液相色谱法检测发酵前后提取液中绞股蓝皂苷的含量变化。

高效液相色谱条件为，色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5 m，250 mmx4.6 mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（32∶68）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 uL。样品中人参皂苷Rb1 的含量（X1）以质量分数（%）表示，计算方式为：X1=（P1×m2×n1）/（P2×m1×n2）×100%。其中P1 为样品溶液峰面积值；m2 为标准品称样质量（g）；n1为样品稀释倍数；P2为标准品溶液峰面积值；m1为样品称样质量（g）；n2为标准品稀释倍数。

2 结 果

2.1 发酵培养基及发酵时间优化

不同碳源在不同发酵时间对凝结芽孢杆菌数量的影响结果如图1所示。由图1可知，葡萄糖、淀粉及玉米粉作为碳源时，凝结芽孢杆菌的数量随着发酵时间的增加呈现先增加后减少的趋势，其中凝结芽孢杆菌的数量在发酵48 h时达到高峰。在发酵48 h时，用玉米粉发酵的凝结芽孢杆菌数量明显比用葡萄糖和淀粉发酵的数量高，呈差异性显著，所以在发酵时间为48 h时，最佳发酵碳源为玉米粉。

图1 不同碳源在不同发酵时间对凝结芽孢杆菌数量的影响

不同氮源在不同发酵时间对凝结芽孢杆菌数量的影响结果如图2所示。由图2可知，硫酸铵、酵母浸出物及蛋白胨作为氮源时，凝结芽孢杆菌的数量随着发酵时间的增加呈现先增加后减少的趋势，其中凝结芽孢杆菌的数量在发酵48 h时达到高峰。在发酵48 h时，用蛋白胨发酵的凝结芽孢杆菌数量明显比用酵母浸出物和硫酸铵发酵的数量高，呈差异性显著，所以在发酵时间为48 h时，最佳发酵氮源为蛋白胨。

图2 不同氮源在不同发酵时间对凝结芽孢杆菌数量的影响

2.2 发酵产物有效成分检测

发酵前后皂苷含量的变化如图3所示。由图3可知，相较发酵前，发酵后绞股蓝皂苷的含量大大提高，呈差异性极显著。说明凝结芽孢杆菌发酵可以降解药材中的纤维素，促进复方中药的有效成分溶出。

图3 发酵前后皂苷含量的变化

发酵前后多糖含量的变化如图4所示。由图4可知，相较发酵前，发酵后总多糖的含量大大提高，呈差异性显著。说明凝结芽孢杆菌发酵可以分解药材的细胞壁，促使多糖从细胞壁或者蛋白复合体中游离出来。

图4 发酵前后多糖含量的变化

3 讨论

为确保食品安全、降低耐药性风险及抗生素残留造成的危害，世界各国纷纷在食品动物饲养过程中实行“减抗”、“禁抗”政策，研究开发新型抗生素替代产品以减少抗生素的使用是一条可行之路。

发酵中兽药作为一种新型抗生素替代产品，成为目前畜牧业研究的热点。该研究通过单因素试验法采用凝结芽孢杆菌对中药复方进行固体发酵，摸索凝结芽孢杆菌发酵中药的最佳碳源为玉米粉，与李登云、崔东良等研究结果一致；最佳氮源为蛋白胨，最优发酵时间为48 h。

黄芪、白术、防风及绞股蓝作为一种提升机体免疫力的中药组方，其发挥功能的主要有效成分是多糖类和皂苷类物质。该研究通过检测发酵前后多糖类和皂苷类的含量变化，研究发现发酵后可有效提高多糖及皂苷等有效成分的溶出，为后期发酵复方中药在临床中应用奠定基础。

4 小结

通过用凝结芽孢杆菌对复方中药进行发酵，摸索发酵最佳碳源、氮源及发酵时间，并检测发酵前后凝结芽孢杆菌含量及总多糖、绞股蓝皂苷含量的变化。试验结果表明：最佳发酵碳源为玉米粉，最佳发酵氮源为蛋白胨，最优发酵时间为48 h。该发酵条件下，凝结芽孢杆菌含量增加，发酵的复方中药有效成分总多糖及绞股蓝皂苷含量增加。□