甘蔗中次生代谢产物和保护酶与螟虫抗性的相关性研究

王 辉，阿迪拉·阿迪力，杨乃博，熊 焰，伍苏然*

(1中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571001；2北京农学院，北京100096)

0 引言

甘蔗(学名：Saccharum officinarum英文名：Sugarcane)是重要糖料作物，在我国广西、云南、广东、海南、福建、台湾等地区广泛种植。由于甘蔗种植面积大，宿根蔗可多年种植，从而导致虫害严重，而为害甘蔗最严重的是甘蔗螟虫。甘蔗螟虫主要包括条螟、大螟、二点螟、红尾白螟和黄螟，在我国各蔗区均有发生，在甘蔗的整个生长阶段都严重危害甘蔗。受螟虫危害后的甘蔗平均产量损失10%～25%[1]，其糖分降低0.93%～3.5%[2]。

螟虫害防治方法有化学防治、生物防治和综合防治法等[3]。化学防治多选择使用杀虫剂，对人体和环境都有毒害，生物防治和综合防治法虽然安全环保，但是防治效果比较缓慢。近年来，我国甘蔗螟虫普遍发生并造成严重危害，使防治甘蔗螟虫为害已成为当前甘蔗生产上的一项重要工作。利用品种对害虫的不敏感性，对害虫种群实施控制，不但有利于害虫的防治，也有利于减少环境污染、维持生态系统的平衡。利用甘蔗自身抗虫特性选育抗虫品种的甘蔗，是目前公认最根本、经济效率高和对环境影响最少的办法[4]。目前育种工作者已选育了许多甘蔗抗虫品种，对螟虫有不同程度的抵御能力，但是其抗虫机理尚未被阐明。

植物被昆虫取食后，植物体内可产生一些次生代谢产物，这些化合物对昆虫有毒或者可避免昆虫取食，以降低昆虫对植物的危害[5]。同时，当植物受到虫害胁迫后也会激活各种保护酶或防御酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxisome，POD)、多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)等，从而生成防御物质，直接毒杀害虫，驱避害虫或招引其天敌，对植物进行相应的保护[6]。茉莉酸类化合物(Jasmonates)是一种植物内源生长激素，用于调节植物生长发育、代谢途径和抵御害虫入侵[7]。研究表明：利用外源茉莉酸类化合物同样可以诱导植物产生防御反应，与抵御病原微生物或虫害入侵产生同样的效果[8]。

本研究利用茉莉酸甲酯对苗期不同品种甘蔗进行处理，比较螟虫抗性/易感甘蔗品种体内保护酶和次生代谢产物的差异，旨在为甘蔗的抗虫品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验前期对海南蔗区不同甘蔗种质对螟虫抗性差异进行了比较，发现粤甘34号、云蔗03-258和粤甘26号具有很好的螟虫抗性，而德蔗03-83号、粤甘 35号和柳城 03-1137则属于螟虫易感品种，ROC22号对螟虫的抗性居中[9]。因此，本实验采用的甘蔗品种为螟虫抗性品种粤甘34号、云蔗03-258和粤甘 26号；螟虫易感品种德蔗 03-83、粤甘 35号和柳城03-1137；对螟虫的抗性介于抗性品种和易感品种之间的ROC22号，该品种目前在海南大规模种植。

1.2 实验方法

将选取的甘蔗品种于2014年1月在中国热带农业科学院热带生物技术研究所温室内进行盆栽，生长1个月后，即2月份甘蔗长出5片叶子时，进行茉莉酸甲酯处理。

茉莉酸甲酯处理：用可调式喷雾器均匀的将配制好的茉莉酸甲酯喷施在植株叶片上，有水珠挂在叶片上是最宜的喷施程度。在用完茉莉酸甲酯处理72 h后，测定各样品的总酚、单宁的含量以及过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性。分别把每个品种重复3次。

1.2.1 总酚含量的测定

(1)样品的提取：称取甘蔗心叶以下第一片叶0.5 g，加入95%乙醇后将其研磨成匀浆，然后用浓度为95%的乙醇提取3次，转入离心管中，以10000 r/ min的速度离心10 min，取上清液后定容至10 mL待测。

(2)总酚的测定[10]：将样品溶液稀释至100倍后取2 mL加入至试管，加入l mL Folin-Ciocalteu试剂，摇3 min摇匀后，加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，静置1 h后，用紫外分光光度计测定在670 nm处的OD值。用邻苯二酚配置标准液，制作标准曲线。

1.2.2 单宁含量的测定

(1)样品的提取：称取1 g叶片，在冰浴中加蒸馏水研磨成匀浆，连同残渣转入离心管中，用蒸馏水提取3次后以1000 r/min的速度离心10 min，取上清液定容至10 mL，在20℃条件下保存备用。

(2)单宁的测定：取1 mL待测液，加入50 μL福林酚显色剂和 10% Na2CO3溶液 4 mL，静置 30 min，用紫外分光光度计测定在760 nm处的OD值。

1.2.3 过氧化氢酶(CAT)活力的测定

(1)酶液的提取：称取甘蔗新鲜叶片0.5 g，置研钵中，加少量石英砂，在4℃下预冷的pH 7.8磷酸缓冲液3 mL后研磨成匀浆，把研钵用缓冲液冲洗3次，定容至25 mL。混合均匀后将溶液移入5℃冰箱中静置l0 min。吸取上清液在离心机中以4000 r/min的速度离心15 min，再次吸取上清液，得酶液，保存于4℃条件下备用。

(2)酶活力的测定：用10 mL试管取一定量的酶，在25℃条件下预热后，加入0.3 mL 0.l mol/L的H2O2后立即计时，在紫外分光光度计240 nm下测定吸光度，每隔1 min读数1次，计算酶活性。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的测定

(1)酶液的制备：准确称取新鲜叶片 1 g，剪碎后放入研钵，加入配制好的提取液(0.1 mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲液内含7% PVP和10% TritonX100)20 mL，与少量石英砂在冰浴条件下研磨成匀浆，再加入10 mL提取液，转入离心管，于4℃左右8000 r/min离心5 min，取上清，得酶液，待测。

(2)酶活力的测定：取1 mL酶液，加入上述提取液2 mL，再加入苯二酚1 mL，混匀后立即用紫外分光光度计在405 nm处测定其吸光度，1 min后测第2次，记录2次差值，以每分钟变化0.01为1个酶活力单位，对测定结果进行计算。

1.2.5 过氧化物酶(POD)活力的测定

(1)酶液的提取：准确称量采集的甘蔗新鲜叶片0.l g，放入研钵中，加适量 0.2 mol/L的 pH 6.0 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆移入离心管，用适量磷酸缓冲液冲洗研钵，在低温条件下以4000 r/min的速度离心15 min。取上清液，定容至10 mL。低温下贮存备用。

(2)酶活力的测定：过氧化物酶活力采用愈创木酚法。量取50 mL上述磷酸缓冲液于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，放在磁力搅拌器上搅拌，待愈创木酚完全溶解后加入19 μL30% H2O2，均匀混合。加入1 mL待测酶液于3 mL上述混合液中，迅速混匀后，倒入比色皿用分光光度计于470 nm处测定吸光度，每分钟测定1次，过氧化物酶活性单位(U)以每分钟测定值变化0.01作为1个表示，计算其酶活力。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定

(1)酶液的提取：准确称取 0.5 g新鲜叶片，将其剪碎，加入4 m150 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液和5 mLPVPP，冰浴研磨成匀浆后加入4 mL PBS溶液漂洗，转入离心管，10000 r/min离心20 min，取上清液，弃残渣，定容至10 mL，得待测酶液。

(2)酶活力的测定：取试管若干支，2支试管为对照，按表1加样，加样时尽量避光。加样后混匀，将一支对照试管置于暗处避光，作为校零对照管，其它试管在光照下反应20 min后在560 nm处测吸光度，对酶活性进行计算。

表1 测定SOD的反应体系

2 结果与讨论

2.1 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种总酚和单宁含量的比较

茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种总酚含量如图1所示，抗螟虫甘蔗品种粤甘34号、云蔗03-258、粤甘26号的总酚含量无显著差异，但均显著高于ROC22号和易感螟虫品种德蔗 03-83、粤甘 35号、柳城03-1137。易感螟虫品种德蔗03-83、粤甘35号、柳城03-1137的总酚含量无显著差异。ROC22号的总酚含量位于感、抗螟虫品种之间，且与其它品种总酚含量差异显著。可见甘蔗受到胁迫后的总酚含量与甘蔗品种的螟虫抗性有关，螟虫抗性越强，总酚含量越高。经茉莉酸甲酯处理后粤甘 34号和云蔗03-258的单宁含量显著高于其他甘蔗品种，粤甘26号与 ROC22号差异不显著，显著高于易感螟虫品种，ROC22号与德蔗03-83差异不显著，显著高于粤甘35号和柳城03-1137，如图2所示。经茉莉酸甲酯处理后甘蔗品种间差异性显著，抗螟虫甘蔗品种的单宁含量均比易感螟虫品种的单宁含量高。

图1 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种总酚含量的比较

图2 甘蔗品种单宁含量的比较

植物中的许多次生代谢产物往往可以毒杀昆虫或者具有昆虫拒食活性，从而对植物自身起到保护作用，被昆虫取食后其次生代谢产物含量的高低也直接反应了其抗虫性的高低。如不同苜蓿品种在豌豆蚜为害后，抗虫品种的总酚含量始终高于低抗品种和感虫品种[11]。棉花被尺蠖取食后，其体内单宁、棉酚、槲皮素、芦丁和氯原酸含量显著增加[12]。本研究所选甘蔗品种在茉莉酸甲酯诱导后螟虫抗性品种中总酚和单宁的含量明显高于螟虫易感品种，可见其抗虫性和其在虫害胁迫下次生代谢产物的生成有关。

2.2 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种中CAT活性的比较

经茉莉酸甲酯诱导后的7个甘蔗品种CAT活力由高到低分别为粤甘34号、云蔗03-258、粤甘26号、ROC22号、德蔗 03-83、粤甘 35号和柳城03-1137，如图3所示，且各个甘蔗品种间 CAT活力均有显著差异。螟虫抗性甘蔗品种的CAT活性显著高于螟虫易感品种。

图3 茉莉酸甲酯诱导CAT活性的比较

CAT能催化H2O2分解为H2O和O2，降低多余的活性氧对细胞的损害，是植物为防御外界不良环境而产生的保护酶。绿豆受到豆蚜胁迫后，抗、易感品种CAT活性分别上升236.515%和124.426%，存在极显著差异[13]。不同苜蓿品种受到豌豆蚜胁迫后，其高抗品种的CAT 活性始终高于低抗品种和易感品种[11]。研究结果表明：CAT活性与甘蔗的抗螟虫活性呈正相关性，结果与文献报道相符。

2.3 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种中PPO活性的比较

茉莉酸甲酯诱导后各甘蔗品种PPO含量如图4所示，甘蔗品种间PPO活性差异与感、抗螟虫害的严重程度基本一致，PPO活性越高，抗螟虫性越强。抗螟虫品种粵甘34号、云蔗03-258、粤甘26号的PPO活性显著高于 ROC22号以及易感螟虫品种德蔗 03-83、粤甘 35号、柳城 03-113；ROC22号的PPO活性显著高于易感螟虫品种。

图4 茉莉酸甲酯诱导PPO活性的比较

PPO是与植物抗虫性物质关系密切的酶类物质，可催化酚类物质氧化为醌，并将一些必需氨基酸烷基化，从而使醌类物质抑制虫害的消化系统，使其营养失衡。害虫抗性作物在虫害胁迫后，其PPO活性的提高文献多有报道，如抗烟粉虱的黄瓜品种在人工接种烟粉虱后，其 PPO的活性明显高于对照[14]；绿豆受到豆蚜胁迫后，豆蚜抗性品种PPO提高了359.674%，而易感品种的PPO活性仅仅提高了67.445%[13]。本研究结果也证实了在茉莉酸甲酯胁迫下抗螟虫品种的甘蔗PPO活性显著高于易感螟虫品种，可见PPO活性可以为抗虫品种选育作参考。

2.4 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种中POD活性的比较

茉莉酸甲酯诱导后POD含量如图5所示，甘蔗品种间POD活性差异显著。粤甘34号的POD活性显著高于其它品种材料，POD活性由高到低依次为云蔗03-258、粤甘26号、ROC22号、德蔗03-83、粤甘35号和柳城03-1137；抗螟虫性品种的POD活性均显著高于易感螟虫品种。

图5 茉莉酸甲酯诱导POD活性的比较

POD参与植物体内木质素的合成，其活性的增强可使得植物体内木质素积累，从而防止昆虫取食[15]已有文献报道，圣女果受到B型烟粉虱胁迫后，抗虫品种体内的 POD活性的升高明显高于感虫品种[16]，这与实验结果一致，说明POD活性是植物抗虫性的标志之一。

2.5 茉莉酸甲酯诱导后甘蔗品种中SOD的活性比较

茉莉酸甲酯诱导后的7个甘蔗品种材料SOD活性(见图6)，粤甘34号的SOD活性显著高于其他品种材料，其次是云蔗03-258和粤甘26号；ROC22号位于感、抗品种材料之间。抗螟虫品种的SOD活性均高于易感螟虫品种德蔗03-83、粤甘35号、柳城03-1137。

图6 茉莉酸甲酯诱导后不同甘蔗品种SOD活性的测定

SOD可将植物体内的活性氧歧化，产生过氧化氢和氧气，为其它保护酶参与活性氧代谢提供底物，是活性氧代谢的第一步反应[17]。所以SOD活性的提高对植物应对逆境胁迫(包括虫害)有重要作用。如北抗杨受虫害后，其木质部的SOD活性高于未受虫害的木质部[18]。马铃薯受到马铃薯块茎蛾取食后，其叶片中SOD活性高于未受取食的叶片[19]。本研究中抗螟虫甘蔗品种的 SOD活性均高于易感螟虫品种，表明SOD活性可以作为螟虫抗性选育的指标。

3 结论

经外源茉莉酸甲酯诱导后，抗螟虫品种粤甘34号、云蔗03-258、粤甘26号的总酚和单宁含量以及几种保护酶过氧化氢酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性均高于螟虫易感品种粤甘35号、德蔗03-83和柳城03-1137。茉莉酸甲酯诱导后甘蔗中次生代谢产物含量与保护酶活性均与甘蔗螟虫抗性呈正相关，因此，可以作为评判甘蔗品种抗虫性的重要指标。