液相色谱荧光法测定食糖中的多环芳烃及其消费风险评估

李长成，陈其钊*，陈嘉敏，王桂华，黄敏兴，高裕锋

(1广东省科学院生物与医学工程研究所，广东广州510316；2国家糖业质量检验检测中心，广东广州510316)

0 引言

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一大类由2个或多个稠合芳香环组成的有机化合物。PAHs主要形成于有机物的不完全燃烧和热解。工业食品加工(如加热、干燥和吸烟过程)和家庭食品制备(如烧烤和焙烤过程)是多环芳烃产生的原因之一。由于其致突变性和致癌作用，PAHs在食品安全方面非常令人关注。在2002年，前食品科学委员会(Scientific Committee on Food)确定了15种多环芳烃为致癌物质，并建议使用苯并[a]芘作为食物中致癌多环芳烃的发生和影响的指标。

根据食品安全委员会的意见，为那些生产过程中暴露于多环芳烃并被发现含有较高含量多环芳烃的食品(如油、培根及培根制品、熏鱼及熏鱼制品、熏鱼以外的鱼肉、甲壳类动物、头足类动物、双壳类软体动物及婴儿食品)设定了苯并[a]芘的最高限量[1]。在2005～2007年间，18个欧盟成员国测试了33个食品类别/次类别的9714个不同的样本，结果显示31.8%的样本的PAHs水平低于LOD。其中，在糖和糖制品中检测了巧克力，数据显示总量(PAH8)为 0～2.76 μg/kg。欧洲食品安全局食物链污染物科学小组在2008年更新了其关于食品中多环芳烃(PAHs)的观点[2]，认为苯并[a]芘不是食物中是否含有多环芳烃的合适标记物，而由 4种特定物质(PAH4)或 8种特定物质(PAH8)组成的体系将是食物中多环芳烃的最合适指标，并据此意见修订了相关限值[3]。

有文献报道在巴西的糖样(颗粒糖、巴西原糖、冰糖、红糖、有机糖)中检出多环芳烃的比例为57%，含量最高为 1.35 μg/kg，在生蔗汁和炭化蔗汁[4-7]中更高，达3.05 μg/kg。可见环境中的PAHs可以在甘蔗体内迁移、代谢、累积，从而影响甘蔗的正常生长，且可在食物链中被逐级放大，影响人类健康。但是目前我国还没有专门为食糖设定PAHs限量，对不同食糖中多环芳烃含量仍不明确。为此，本研究筛选中国市场上 3种类型的食糖对规定的15种优先控制的多环芳烃进行了检测，探讨多环芳烃在不同食糖中的分布特征，并对成人摄食每种食糖引起的健康风险进行了评估，旨在为定量评价食糖污染的生态风险、保障食品安全质量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2017/18 年和2018/19年2个榨季期间，从广东、广西、云南糖厂和超市随机抽取 104个食糖样品，每个样品的质量在500～750 g之间：其中44个红糖、13个黑糖、47个赤砂糖样品。在分析之前，所有食糖样品都储存在塑料罐中，阴凉避光保存。

乙醚、石油醚、氯化钠(分析纯，广州化学试剂有限公司)；乙腈、正己烷、二氯甲烷(色谱纯，赛默飞公司)；16种多环芳烃标准溶液(200 μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司)；QuEChERS净化管，Cleanert Florisil固相萃取柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；MIP-PAHs固相萃取柱(500 mg/6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司)。

由于苊烯(Acy)没有荧光吸收，本文中只讨论分析 15 种代表性 PAHs：萘(Nap)，苊(Ace)，芴(Fln)，菲(Phe)，蒽(Ant)，荧蒽(Flt)，苯并[a]芘(BaP)，芘(Pyr)，苯并[a]蒽(BaA)，苯并[b]荧蒽(BbF)，苯并[k]荧蒽(BkF)，二苯并[a,h]蒽(DhA)，苯并[g,h,i]苝(BpE)，茚并[1,2,3-c,d]芘(InP)，䓛(CHR)。

1.2 仪器与设备

Waters e2695型高效液相色谱仪，配备 2475荧光检测器(美国 Waters公司)；色谱柱 ZORBAX Eclipse PAH(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美国安捷伦公司)；CL5R医用离心机(湖南湘仪公司)；N-EVAP 112氮吹浓缩仪(美国Organomation公司)；12位固相萃取仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；涡旋仪(德国IKA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

配置浓度为(200±0.2) μg/mL的16种多环芳烃的混标溶液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，于4℃下避光储存备用。取适量部分上述标准储备液用乙腈配制成浓度分别为 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL系列标准工作液。

1.3.2 样品制备

通过总结文献[8-13]的研究方法，以及前期的实验探索，比较了乙腈、正己烷、二氯甲烷作为萃取溶剂的提取效率和 MIP-PAH、QuEChERS以及Cleanert Florisil的净化效果。不同提取溶剂的提取效果的色谱见图1，根据响应值最终确定以正己烷∶二氯甲烷(1∶1)作为萃取溶剂。不同净化方式的净化效果的色谱见图2，结果显示Cleanert Florisil柱净化的回收率最好，为 72%～113%。具体操作为：称取3 g试样于离心管中，加入3 mL水。在涡旋溶解后，加入5 mL正己烷∶二氯甲烷(1∶1)溶液再涡旋后5 min。然后将样品以4000 r/min离心5 min，取上层有机层。共萃取3次，合并有机层，氮气吹至近干。加入5 mL正己烷，涡旋振荡30 s溶解，待净化。依次用5 mL二氯甲烷和10 mL正己烷活化Cleanert Florisil柱，将待净化液全部移入Cleanert Florisil柱，再用5 mL正己烷润洗1次，用8 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液洗脱，收集所有流出物于20 mL玻璃离心管中。氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，混匀后，过0.22 μm滤膜，制得试样待测液[14]。

图1 不同提取溶剂的提取效果色谱图

图2 不同净化方式的净化效果色谱图

1.3.3 色谱条件

使用Waters e2695 HPLC进行色谱分析，2475荧光检测器和Empower3软件，ZORBAX Eclipse PAH色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈和水作为流动相，以1.5 mL/min的流速进行梯度分离。梯度洗脱程序如下：50% ACN(0～5 min)，增加至100% ACN(5～20 min)，100% ACN(20～28 min)，降低至50% ACN(28～32 min)，50% ACN(32～36 min)。参考文献[15-16]及国标中一些PAHs的最佳激发及发射波长，结合不同 PAHs保留时间的差异，优化确定荧光检测程序见表1，采用优化后的条件，对比标准溶液、溶剂空白以及空白加标的 15种 PAHs的色谱图，如图3所示。

表1 荧光检测程序

图3 多环芳烃标准溶液(A)、溶剂空白(B)和空白加标(C)的HPLC-FLD色谱图

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 线性范围

精密吸取一定体积的混合对照品储备液，按倍数关系稀释成不同质量浓度的标准溶液进行测定，采用优化后的前处理方法以及色谱条件，以15种多环芳烃浓度为横坐标(x)，对应的峰面积平均值为纵坐标(y)，绘制标准曲线；以信噪比S/N=3确定仪器检出限(LOD)。结果如表2所示，15种多环芳烃在1～20 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.9990；定量限在0.011～0.76 µg/kg之间，检出限在0.0032～0.23 µg/kg之间，方法灵敏度较高，可满足糖品中多环芳烃检测需要。

表2 线性、定量限、检出限、精密度、重复性和回收率平均值

2.1.2 精密度试验

取供试品溶液(加标10.0 µg/kg)按照1.3节色谱条件连续进样 6次进行精密度试验，表2结果显示，15种多环芳烃峰面积的精密度为 2.0%～9.4%，表明仪器的精密度良好。

2.1.3 加标回收率

精确称取红糖样品3.0 g，按重复性结果计算得到15种多环芳烃的含量，分别加入3个水平的对照品，在最佳提取条件及色谱条件下，每一浓度平行3次测定15种多环芳烃的回收率，结果见表2。15种多环芳烃的平均回收率为 72.3%～94.3%，能够满足15种多环芳烃检测的需要。

2.2 15种多环芳烃的检测结果

104个样品的测定结果显示(表3)，(美国)环境保护局(EPA)优先污染物列表中确定的所有 16种多环芳烃有12种成分被检出，其中，最大检出量为 25.29 µg/kg。在 37.5%的样本中，检测到单个PAHs(Nap、Fln、Pyr)的含量＞1.0 µg/kg。Phe的中位值最高为 1.33 µg/kg，其次是 Fln(0.30 µg/kg)。而BaP的中位数低于检出限，仅为0.027 µg/kg。由表3可知，食糖中的PAHs主要为三环和四环的PAHs，其中Fln、Phe的检出率为100%，Flt、Pyr的检出率次之，分别为99%和98.1%。

表3 糖品中15种多环芳烃的分析结果

注：＜LOD(%)为含量低于检出限的个数(比例)。

2.3 不同食糖中的多环芳烃含量

表3显示了不同食糖中单个多环芳烃的结果。研究发现有11种多环芳烃在赤砂糖样品中检出，而且含量也比较高，而在其他大多数样品中检测到的浓度都很低。

表3显示了 BaP、PAH2(BaP+CHR)、PAH4(BaP+CHR+BaA+BbF)、PAH8 (PAH4+BkF+DhA+BpE+InP)的总和。其中大部分样品(88.5%)的 BaP含量均小于检出限。PAH2、PAH4和PAH8最大值均小于1.0 μg/kg(欧盟的最低限量值)。其中BaA、DhA 在赤砂糖中检测到最大值，为 0.16 µg/kg，86.5%的BaA含量大于检出限，提示它是影响食糖PAHs风险值比较大的因素。与BaP和PAH2相比，PAH4和PAH8可以更好地表明遗传毒性和致癌性PAH的发生和毒性。但是与PAH4相比，检测PAH8的数量不会提供太多附加值，因为从数据上看PAH8的检出率并没有增加多少。此外，PAH8中的4个附加PAH(与PAH4相比)不太相关，因为他们在食品中并不常见。

相关文献提供了不同的测定结果。在巴西，报告了 57%的食糖样品中检测到多环芳烃，总含量小于 1.35 μg/kg。其中 51%的糖样品中检出苯并[a]蒽，而在所有样品中均未检测到二苯并[a,h]蒽[11]。在95%的巴西原糖样品中检测到多环芳烃，总量小于4.03 μg/kg。其中含量最高的是芘，占样品总量的 67%，其次是蒽，占 48%。所有样品中均未检测到萘、苊烯、芴和茚并[1,2,3-c,d]芘[9]。另有研究者对40份甘蔗汁样品进行了检测，发现有4个普通样品和甘蔗收割期的样品中有12个样品的PAHs含量超过检出限，分别为0.006～0.021 μg/kg 和 0.008～0.290 μg/kg。其中最具代表的多环芳烃是苯并[b]荧蒽，约 30%的样品中有检出。而苯并[k]荧蒽则在任何分析样品中均未检测到[17]。

Camargo和 Toledo进行的一项研究中，9个白糖样品中5种多环芳烃(苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽)的平均总和水平为6.15 μg/kg，其中二苯并[a,h]蒽的含量最高为5.17 μg/kg。有报道称白糖和红糖中PAHs的总和水平有明显的差异，这种差异可能与 2个因素有关：①加工过程中的差异：白糖在生产加工过程中经过清净工艺，降低了产品中的 PAHs水平[18]，而红糖没有经过高度精炼，几乎保留了蔗汁中的全部成分；②使用的甘蔗类型(烧过或没有焚烧)的差异：甘蔗作物在收获前被焚烧时，是多环芳烃(PAHs)排放的重要来源[17]。

2.4 风险评估

对于遗传毒性和致癌性污染物的风险评估，食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧洲食品安全局(EFSA)都建议使用暴露裕度(MOE)方法。基于EFSA确定的毒理学数据，以BaP、PAH2、PAH4和PAH8 4个替代指标物具有10%额外肿瘤发生风险的 95%置信区间下限值(BMDL10)作为 PAHs混合物的致癌效应参考点，分别为0.07、0.17、0.34和 0.49 mg/(kg·d)[19]。

MOE值计算见公式：

MOE=BMDL10/每日膳食暴露量

依据公式为：

其中：Yi为每人每日膳食食糖中 PAHs暴露量[ng/(kg·d)]；Xi为每人每日膳食食糖消费量(g/d)；Ci为膳食食糖中 PAHs的含量(ug/kg)；Wi为体重(kg)。

PAHs含量(Ci)分别选取 BaP、PAH2、PAH4、PAH8含量的平均值、P50以及P953个统计参考点值(见表4)；居民食糖消费量(Xi)数据使用2015/16年榨季我国人均食糖消费量[20]及参考体重为 60 kg。暴露定量风险评估居民每日膳食食糖PAHs暴露量评估结果见表5，致癌风险评估结果见表6。结果显示在平均暴露水平(均值和P50值)以及高暴露水平(P95值)时的MOE值均远大于10000，健康风险较低。EFSA提到，对于普通消费者来说，当MOE值远大于10000时，表明对消费者健康的影响程度较低[19]。

表4 食糖中BaP、PAH2、PAH4及PAH8含量(n=90)

表5 我国居民食糖中多环芳烃暴露量评估结果

表6 我国居民食糖中多环芳烃致癌风险评估的暴露限值

3 结论

本研究用正己烷∶二氯甲烷(1∶1)提取样品后，采用Cleanert Florisil净化，净化后的样品进行HPLC-FLD检测。结果表明，食糖中15种PAHs的加标回收率为 72.3%～94.3%，RSD为 2.0%～9.4%，该方法高效、快速、灵敏度高，可以用于食糖中15种PAHs的定量分析。104个食糖样品均检出含有多环芳烃。检出次数最多的成分为芴、菲、荧蒽和芘。在所有样品中，BaP、PAH2、PAH4、PAH8的含量均小于l.0 μg/kg，并且MOE值均远大于10000，这些结果表明对消费者健康的影响程度较低，本研究为定量评价食糖污染的生态风险、保障食品安全质量提供理论基础。