狐源屎肠球菌的分离鉴定及药敏试验

魏成威，刘 琳，王新宇，白 荟，高 利*

(1.东北农业大学动物临床教学医院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

肠球菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢的兼性厌氧菌，是温血动物和人类胃肠道的共生菌[1]。粪肠球菌和屎肠球菌是其中的两大类，被认为是引起人类医院内感染的主要原因[2]。屎肠球菌曾被认为对人类及动物机体是无害的，并且很长一段时间内在食品工业中作为益生菌等添加物被广泛使用[3]。近年来的研究显示,屎肠球菌作为条件致病菌在肠道抵抗力降低及长期患病(如肾脏疾病、肿瘤等)致免疫力低下时可引起人和动物发病[4]。在美国，肠球菌是医院内感染的第二大原因，粪肠球菌和屎肠球菌分别占每年感染的6.8%和4.1%[5]。动物感染屎肠球菌因种属不同及个体差异表现不同的症状。

本研究从病死狐的肺部分离到1菌株，经形态学检查、16S rRNA鉴定、药敏试验、毒力基因检测及致病性试验确定为屎肠球菌感染。狐狸是一种重要的经济动物，但是国内对于狐感染屎肠球菌的报道很少，通过药敏试验和动物试验来确定该菌临床用药的敏感性和致病性，为该病临床治疗和流行病学调查提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料来源于某狐狸养殖场送检到兽医院的死亡狐狸，从肺脏中采集的组织。

1.1.2 实验动物 SPF小鼠7只，购自辽宁长生生物有限公司。

1.1.3 试剂和仪器 血平板，南京—基生化有限公司产品；rTaq酶、10×PCR buffer、dNTP，宝生物工程(大连)有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，北京索莱宝生物有限公司产品；DHP-360电热恒温培养箱，天津市中环实验电炉有限公司产品；DYY-Ⅲ型电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 16S rRNA的片段长度为1 500 bp，上游引物27F，引物序列为5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'，下游引物1429R，引物序列为5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

屎肠球菌的毒力基因cyt的片段长度为475 bp，上游引物为CYT-1，引物序列为5'ACTCGGGGATTGATAGGC3'，下游引物为CYT-2，引物序列为5'GCTGCTAAAGCTGCGCTT3'；屎肠球菌种属基因包含hyl、asa、ace、gel、esp、tuf，基因hyl片段长度为276 bp，上游引物为HYL-1，引物序列为5'ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG3，下游引物为CYT-2，引物序列为5'GACTGACGTCCAAGTTTCCAA3'；基因asa片段长度为375 bp，上游引物为ASA-11，引物序列为5'GCACGCTATTACGAACTATGA3'，下游引物为ASA-12，引物序列为5'TAAGAAAGAACATCACCACGA3'；基因ace片段长度为320 bp，上游引物为ace1-F，引物序列为5'AAAGTAGAATTAGATCACAC3'，下游引物为ace2-R，引物序列为5'TCTATCACATTCGGTTGCG3'；基因gel片段长度为213 bp，上游引物为GEL-11，引物序列为5'TATGACAATGCTTTTTGGGAT 3'，下游引物为GEL-12，引物序列为5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因esp片段长度为510 bp，上游引物为Esp-14F，引物序列为5' AGATTTCATCTTTGATTCTTGG3'，下游引物为Esp-12R，引物序列为5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因tuf片段长度为112 bp，上游引物为tuf-F，引物序列为5'TACTGACAAACCATTCATGATG3'，下游引物为tuf-R，引物序列为5'AACTTCGTCACCAACGCGAAC3'。

1.2.2 细菌的分离与生化鉴定 用灭菌的接种环蘸取少许病狐的肺部组织，划线接种于血清LB平板、麦康凯平板，血琼脂平板中，37 ℃温箱中培养18 h～24 h。观察细菌生长情况和菌落特征并进行革兰氏染色，接种于发酵管中进行生化试验。

1.2.3 细菌的16S rRNA的测定 提取细菌的基因组，将菌液反复吸取混匀后，吸取200 μL 12 000 r/min离心1 min，弃去上清，保留沉淀。加入去离子水200 μL，冲洗，12 000 r/min离心1 min，弃去上清，保留沉淀，重复1次。加入1 mL溶菌酶，反复吹洗，摇床1 h，30 min，离心留沉淀，根据细菌基因组DNA提取试剂盒上的步骤提取基因组。

PCR扩增：PCR扩增体系总体积20 μL，ddH2O 12.8 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mix 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物2F 1 μL，下游引物1492 R 1 μL，模板1 μL。PCR反应进行条件，94 ℃ 5 min；94℃ 40 s,56℃ 50 s,72℃ 90 s，共25个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.4 种属引物测定 细菌基因组的提取步骤同1.2.3。PCR扩增：PCR反应体系总体积为20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，49 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共40个循环。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。产物经鉴定后根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒上的说明书进行回收，回收产物送由吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.2.5 药敏试验 药物试验采用KB法，选取20种常用的抗菌药物进行试验，以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株，试验操作及判定标准按2009年美国NCCLS法规标准进行判定。将分离纯化的菌株，于LB液体培养基中培养8 h～12 h后。用移液枪取200 μL菌液均匀涂布于MH琼脂培养基平板上，自然干燥后，将头孢噻呋钠、万古霉素、氯霉素，庆大霉素、氨苄西林，环丙沙星等20种药敏片平贴于培养基上，37 ℃培养箱放置24 h，判定结果，以抑菌圈直径作为判定指标。

1.2.6 毒力基因鉴定 对屎肠球菌的主要毒力基因gel、esp、asa、cyt、ace、hyl，进行PCR鉴定。PCR反应体系：总体积为20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min,49 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共40个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.7 致病性试验 将分离纯化的菌株于LB液体培养基中培养，于培养箱中37 ℃过夜培养，腹腔注射5只健康小鼠体内，每只小鼠注射0.5 mL，攻毒剂量为5×108CFU，对照组2只小鼠腹腔注射LB液体培养基，隔离饲养，观察记录小鼠发病及死亡情况。对未死亡小鼠5 d后剖检，从肝脏中再次分离细菌。

2 结果

2.1 细菌分离与生化鉴定结果

将病料接种到LB平板培养基上，过夜培养，可见大量蔓延生长的不溶血、不透明的小菌落；接种到麦康凯琼脂平板培养基，过夜培养，其生长情况为黄灰色光滑干燥小菌落。取少量菌体接种于液体LB中培养12 h～24 h，之后接种于血平板中，观察溶血性，可见菌体不溶血。三糖铁斜面培养基37 ℃过夜培养，观察其生化反应，结果为不产酸，不产气，不产H2S。菌体呈现椭圆形或圆形，革兰氏染色阳性。

2.2 16S rRNA鉴定结果

2.2.1 16S rRNA扩增鉴定结果 凝胶块的第一个孔加入DNA标准DL 2 000，分离株16S rRNA基因PCR结果是核酸电泳鉴定分离菌株在1 500 bp扩增出条带。

2.2.2 16S rRNA序列鉴定结果 根据Blast序列比对，可以看出序列一致性为99%(图1)。

2.3 种属引物鉴定结果

该分离菌经PCR扩增出了一条112 bp的条带(图2)。这与屎肠球菌片段大小相一致，结合2.2中的结果，序列同源性为99%，说明该分离菌为屎肠球菌。

2.4 药敏试验结果

采用KB扩散法检测药物敏感性，结果如表1所示，检测的20种抗菌药物中，分离菌株11001对氯霉素和万古霉素表现敏感，对β-内酰胺类、林可酰胺类、四环素类、头孢第三代抗生素、氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类、多肽类、大环内酯类、及呋喃类抗菌药表现耐药。

图1 分离株16S rRNA序列Blast结果

M.DNA 标准DL 2 000;1.tuf;2.阴性对照

表1 分离菌的药敏试验结果

2.5 毒力基因检测结果

提取分离菌的DNA，对分离菌11001进行屎肠球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鉴定，依次扩增出213、276、510、475、375、320 bp片段,与预期条带的长度一致，说明分离菌11001携带屎肠球菌的毒力基因。部分毒力基因PCR结果如图3所示。

M.DNA 标准DL 2 000;1.esp;2.asa;3.ace;4.hyl

2.6 致病性试验结果

试验组的5只小鼠，12 h后5只小鼠出现急性死亡，死亡体态呈现四肢蜷缩状。对照组2只小鼠无明显临床症状。剖检所见，试验组5只小鼠脾脏均有淤血，大肠均充满大量气体，其他脏器未见明显异常。

3 讨论

目前，有关肠球菌感染的报道日渐增多。1899年最早报道肠球菌感染与人的感染性心内膜炎有关[6]，之后的报道显示肠球菌引起一系列医院内感染，包括新生儿败血症、盆腔感染及尿路感染等[7]。动物感染屎肠球菌表现各异，猪感染后多在1 d～3 d内死亡，特征性表现结膜充血、分泌物增多，全身瘀斑及口鼻出血[8]；雏鸡感染屎肠球菌主要表现肝脏肿大、出血等[9]。动物感染屎肠球菌的病例越来越多，狐狸感染的病例报道较少，应引起足够的重视。

本试验从死亡狐狸的肺脏分离到细菌，为革兰氏染色阳性，菌体呈现圆形或椭圆形，不产酸，不产气，不产H2S，滴加30 mL/L H2O2无气泡产生，这与之前的报道中屎肠球菌的形态及生化特征相一致[3]。对分离株进行16S rRNA鉴定以及种属引物PCR扩增，结果显示分离株为屎肠球菌，且扩增结果与之相一致。药敏试验结果显示，该分离株在被检的20种抗菌药物中，仅对氯霉素和万古霉素表现为敏感，对其他抗菌药物均表现耐药，这可能是由于狐狸场在预防及治疗疾病方面的用药习惯导致的。对屎肠球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鉴定，依次扩增出213、276、510、475、375、320 bp片段，与预期条带长度一致，说明分离菌11001可能携带屎肠球菌的毒力基因。Hy1基因主要出现于临床感染的屎肠球菌中，在屎肠球菌致病中起着重要的作用，可能是屎肠球菌的毒力基因之一[10]。分离株在致病性试验中试验组5只小鼠全部死亡，说明该株屎肠球菌有一定的致病性。

屎肠球菌通常存在于环境和机体肠道内，属于条件性致病菌，正常时不易发病[7]，抗菌药物及其他抗菌药物的不合理使用导致屎肠球菌的大量增殖，从而产生致病性[11]。所以应注意公共卫生，提高和加强饲养环境建设，减少疾病的发生。本试验从患病狐狸肺脏着手，分离到屎肠球菌，这在之前狐狸体内病原菌的研究中鲜少报道，其分离鉴定及病原分析结果能为狐狸屎肠球菌感染的研究提供相关数据。但由于时间和试验条件等因素的限制，没有进行厌氧菌、支原体、螺旋体、寄生虫等的培养分离，但不排除有这些病原的并发或继发感染。今后将继续深入研究狐狸感染屎肠球菌的发病原因及预防措施，为狐狸养殖业屎肠球菌感染的防控提供理论支持。