高效液相色谱法测定着色剂食品黄3 中6 种磺酸类杂质

梁文耀，李鑫宇，李焯原，王珍玉，汪毅，聂明霞，谭建华

（1.广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量监督检验中心，广州 511447； 2.广东工业大学，广州 510006）

食 品 黄3(CI 15985)，又 名 日 落 黄(Sunset yellow)，化学名称为1-(对磺苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二钠盐［1］。食品黄3 是一种人工合成着色剂，在食品和化妆品领域，都有较广泛的应用［2］。《化妆品安全技术规范》（2015 年版）规定了食品黄3中6 种磺酸类杂质［4-氨基苯-1-磺酸、3-羟基萘-2，7-二磺酸、6-羟基萘-2-磺酸、7-羟基萘-1，3-二磺酸、4，4'-双偶氮氨基二苯磺酸、6，6'-羟基双(2-萘磺酸)二钠盐］的限量值，其中6，6'-羟基双(2-萘磺酸)二钠盐不超过1.0%，其余5 种总量不超过0.5%［3］，6 种磺酸类杂质的分子结构图见图1。磺酸类杂质对人体有一定危害［4-5］，为了提高着色剂的质量和安全性，需对食品黄3 的杂质含量进行检测。

图1 6 种磺酸类杂质的分子结构图

磺酸类化合物的检测方法主要有化学分析法［6］、液相色谱法［6-11］、分光光度法［11］、高效毛细管电泳法［12］、离子色谱法［13-14］、液相色谱-质谱法［15］等。现有文献报道关于食品黄3 中磺酸类杂质检测的研究较少，主要采用液相色谱法和液相色谱-质谱法。通常参照GB 6227.1-2010 《食品安全国家标准食品添加剂日落黄》［8］中附录A 的方法对原料进行检测。但标准中缺少3-羟基萘-2，7-二磺酸和7-羟基萘-1，3-二磺酸的检测方法，而且4-氨基苯-1-磺酸的保留较弱，易被干扰。因此，现有标准检测方法存在局限性，亟需建立着色剂食品黄3 中6 种磺酸类杂质的检测方法。

笔者采用乙腈和离子对试剂（四丁基溴化铵）水溶液作为流动相，通过优化提取溶剂、色谱条件等因素，建立快速、高效、准确的检测方法，可为食品黄3 中6 种磺酸类杂质的检测提供有效的技术手段，满足化妆品原料质量安全检测的需要。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 型，配二极管阵列检测器（DAD），美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：CPA225D 型，感量值为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

涡旋振荡器：MS3 basic 型，德国IKA 公司。

超声波清洗仪：KQ-250DV 型，昆山市超声仪器有限公司。

聚醚砜滤膜：0.45 μm，天津市津腾实验设备有限公司。

纯水系统：Milli-Q 型，美国Millipore 公司。

6 种磺酸类杂质标准物质：纯度及编号列于表1，均购于上海安谱实验科技股份有限公司。

表1 6 种磺酸类杂质标准物质纯度及编号

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司。

四丁基溴化铵：分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司。

乙酸铵：分析纯，广州化学试剂厂。

食品黄3 原料样品：市售。

实验用纯水：电阻率为18.2 MΩ·cm，由Milli-Q 纯水系统制备。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取6 种磺酸类杂质标准物质各0.01 g（精确至0.01 mg），分别用纯水配制成1 000 mg／L 标准储备溶液。各移取1.0 mL 标准储备溶液于10 mL 容量瓶中，用纯水定容至标线，配制成100 mg／L 混合标准储备液。分别精密移取不同体积的混合标准储备液于10 mL 容量瓶中，用纯水定容，配制成质量浓度分别为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、15.0 mg／L 的系列混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

称取食品黄3 原料样品0.1 g（精确至0.000 1 g）于100 mL 容量瓶中，加纯水定容至标线，混匀，超声提取5 min。冷却至室温，混匀，取适量样品溶液，过0.45 μm 滤膜，供高效液相色谱仪测定。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；流量：1.0 mL／min；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化铵水溶液（4∶6）；检测波长：240 nm。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行检测，6 种磺酸类杂质色谱峰的紫外吸收光谱图见图2。结果显示，6 种磺酸类杂质在240 nm附近均有较强紫外吸收，其中4，4'-双偶氮氨基二苯磺酸在240 nm 和360 nm 有特征紫外吸收。在实际样品测试过程中，可选择240 nm 和360 nm 双波长进行检测，但4，4'-双偶氮氨基二苯磺酸在两个波长下响应差别不明显。考虑到6 种磺酸类杂质在240 nm 波长的响应值能满足方法灵敏度的要求，所以选择240 nm 作为检测波长。

图2 6 种磺酸类杂质标准溶液紫外吸收光谱图

2.2 流动相的选择

分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-25 mmol／L 乙酸铵水溶液、乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化铵水溶液为流动相，考察了6 种磺酸类杂质的色谱峰形和分离效果。结果显示，以甲醇-水和乙腈-水为流动相时，6 种磺酸类杂质保留较弱且存在拖尾现象。在流动相中添加乙酸铵后拖尾现象有所改善，但保留仍然较弱。加入离子对试剂四丁基溴化铵后，有效提高了6 种磺酸类杂质在色谱柱上的保留、分离度和检测灵敏度，且色谱峰形对称。当乙腈与水溶液体积比为4∶6，水溶液中四丁基溴化铵浓度为10 mmol／L 时，6 种磺酸类杂质分离度最佳。因此，选用乙腈-10 mmol／L 四丁基溴化铵水溶液（4∶6）为流动相。6 种磺酸类杂质标准溶液（5 mg／L）色谱图见图3。

图3 6 种磺酸类杂质标准溶液（5 mg／L）色谱图

2.3 色谱柱的选择

考 察 了5 种 相 同 规 格（4.6 mm×250 mm，5 μm）不 同 品 牌（X-bridge C18、ZORBAX SB-C18、Pronto SIL-C18、Ultimate AQ C18和Dimansil C18）C18色谱柱的分离效果。结果显示，在同等色谱条件下，6 种磺酸类杂质在5 种C18色谱柱上色谱峰形差别不明显，ZORBAX SB-C18色谱柱上的色谱峰形最优，且与食品黄3 基质分离良好。因此，最终选用ZORBAX SB-C18色谱柱进行检测。

2.4 提取条件的选择

根据6 种磺酸类杂质的化学性质与结构，分别考察了纯水、25 mmol／L 乙酸铵水溶液、10%乙腈水溶液、10%甲醇水溶液对食品黄3 中6 种磺酸类杂质的提取效果。结果显示，4 种提取溶剂均能地很好溶解目标物，且回收率接近，均大于95%，考虑到操作简便和溶剂毒性，选用纯水作为提取溶剂。超声可以加快目标物溶解析出，在较短的时间内获得较好的提取效果，为了保证样品的充分提取，最终选择先涡旋分散样品，再超声提取5 min 作为提取条件。

2.5 线性方程与检出限

在优化的色谱条件下，对1.2.1 配制的系列混合标准工作溶液进行测定，以目标物的色谱峰面积（Y）对相应的目标物质量浓度（X，mg／L）进行线性回归分析。以3 倍信噪比计算检出限，以10 倍信噪比计算定量限。线性方程、线性范围、相关系数、检出限、定量限见表2。由表2 可知，6 种磺酸类杂质在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r2均大于0.999。方法的检出限和定量限均可满足食品黄3 中6 种磺酸类杂质的检测需要。

表2 6 种磺酸类杂质的线性方程、线性范围、相关系数(r2)、检出限及定量限

2.6 加标回收与精密度试验

称取食品黄3 样品0.1 g（精确至0.000 1 g），共18 份，分别添加低、中、高3 个浓度水平的6 种磺酸类杂质混合标准溶液各6 份，按1.2.2 方法制备加标样品溶液，按1.3 仪器条件进行测定，记录色谱峰面积并计算加标回收率，结果列于表3。由表3可知，6 种磺酸类杂质在3 个加标浓度下的平均回收率为94.3%～99.3%，计算结果的相对标准偏差为0.85%～3.95%（n=6）。说明显示该方法有良好的回收率和精密度。

表3 6 种磺酸类杂质的加标回收与精密度试验结果

2.7 实际样品分析

采用所建立的方法对10 批次来源于化妆品生产企业的食品黄3 原料进行检测，结果列于表4。由表4 可知，10 批次均检出4-氨基苯-1-磺酸和6-羟基萘-2-磺酸，有3 批次检出7-羟基萘-1，3-二磺酸，有8 批次检出6，6'-羟基双(2-萘磺酸)二钠盐，所检10 批次样品所含杂质含量均符合《化妆品安全技术规范》（2015 年版）［3］要求。

表4 实际样品中6 种磺酸类杂质的测定结果 %

3 结语

建立了高效液相色谱法同时测定食品黄3 中6种磺酸类杂质的分析方法。该方法前处理简便、灵敏度高、精密度好，适用于食品黄3 原料样品的检测。对10 批次样品进行了测定，4 种磺酸类杂质有检出，且以6-羟基萘-2-磺酸的检出含量最高。该方法对化妆品用食品黄3 着色剂的质量安全检测提供了有效的技术支持。