双峰驼源乳酸菌的分离鉴定与生物学特性分析

李 瑞，张旺东，李建飞，火兴民，张 睿，刘晓霞，李沛轩，谢 飞，王雯慧

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

近些年随着对肠道微生物多样性及其功能的研究，发现肠道微生物在人类和动物的胃肠道内扮演着重要的角色[1]。微生物学研究表明胃肠道乳酸菌在维持肠道健康起着关键性的作用[1-2]。其在肠道内的组成变化与糖尿病、肥胖、癌症等有着密不可分的联系[2-4]。乳酸菌是一类能利用碳水化合、脂类、氨基酸、蛋白质等进行发酵产生多种代谢产物的革兰氏阳性菌，其对人畜健康的益处除其自身组成物质外也包括其在代谢过程中产生的代谢产物，例如肽聚糖、多糖、细菌素、过氧化氢、乳酸等代谢产物[5-7]。其中乳酸杆菌产生的乳酸不仅通过降低pH来抑制有害菌的生长繁殖，而且还可以通过对革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌等进行渗透作用来阻止它们对肠道的侵袭以减轻肠道黏膜的损伤[8]。近些年随着对抗生素的滥用和误用使得耐药细菌和耐药基因快速出现，从而降低了抗生素对人和动物病原体的治疗潜力也对环境造成了威胁，残留在环境中的抗生素不仅对环境系统产生了破坏，更对生态系统中的人和动物健康造成了威胁[9]。乳酸菌通过对碳水化物进行发酵主要产生乳酸，除了可用于生物降解聚合物的合成外，还可以作为未来绿色化学的原料[10]。

栖息在干旱的荒漠和半荒漠地区的阿拉尔善双峰驼具有多种经济性状和生产性的畜种。驼绒是最好的纺织原料[11]、驼肉是低脂高蛋白的天然绿色食品、驼奶营养丰富，脂肪球小易消化吸收，可开发为绿色保健饮品[12]。作为一个古老的原始品种，在进化过程中形成了许多独特的适应荒漠草原的生物学特性。被誉为沙漠之舟的双峰驼喜食白沙蒿、鳍蓟、沙蓬、梭梭、驼绒藜、白刺等植物，生活在极其恶劣环境下的双峰驼形成了独特的生理功能，如解毒、耐饥渴、耐干旱、耐热、耐寒等特性[13-14]。双峰驼与其他动物在胃的结构上存在着区别，例如牛和绵羊等反刍动物有瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃，但双峰驼却没有瓣胃。研究表明对于大型食草动物而言，食物在骆驼前胃的停滞时间相对较长，因此乳酸菌对胃内的特殊环境的耐受力要高于其他反刍动物，尤其是对胃酸的耐受力[15-16]。乳酸菌在人和动物胃肠道内黏附和定殖是其发挥益生作用的关键。因此乳酸菌必须耐受胃肠道的特殊环境并定殖与肠道黏膜表面，可通过分泌抑制细菌生长的物质来竞争肠道内的营养物质与位置阻止病原菌在肠道内定殖，起到保护和维持肠道平衡来维护胃肠道功能健康的重要作用17。本试验通过对双峰驼十二指肠乳酸菌的分离与鉴定来摸索其生理特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 源于民勤健康双峰驼(阿拉善驼种)壮龄驼(6岁～16岁)。组织样品采自屠宰场，颈动脉放血致死前，静脉注射戊巴比妥钠(20 mg/kg)使其麻醉，迅速开腹取长约10 cm的十二指肠两端用棉线绳扎紧，放入液氮内保存备用。

1.1.2 主要试剂 MRS培养基，革兰氏染色试剂盒，氧化酶试纸，七叶苷，不同糖类生化发酵管，标准药敏试纸片，2×TaqPCR Master Mix，细菌DNA提取试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集 对采集的新鲜双峰驼十二指肠在超净工作台中无菌操作，用灭菌后的剪刀迅速剪开肠管，用无菌生理盐水冲洗肠道，洗去其内容物，用无菌载玻片刮取肠道黏膜放入装入MRS液体培养基的试管中。

1.2.2 细菌的分离鉴定 将样品分别平铺于含有碳酸钙的MRS琼脂培养基平板上，在37 ℃琼培养24 h。随后在培养24 h后的固体培养基上挑取单个含有溶钙圈的菌落，将其接种于含有碳酸钙的MRS琼脂培养基进行反复划线直至革兰氏染色镜检结果为纯菌株的革兰氏染色阳性菌。将纯菌株与甘油(1∶1)混合保存至-80℃超低温冰箱中。

1.2.3 乳酸菌的生化与16S鉴定 参照文献[5-7]将挑选出的纯菌株进行过氧化氢酶的测定、氧化酶的测定、葡萄糖产酸试验、明胶液化、碳酸化合物发酵等生理生化试验。将疑似菌株进行16S rRAN鉴定：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的总DNA，然后采用 16S rRNA通用引物进行PCR扩增以提取的基因组DNA为模板扩增16S rRNA，引物为F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′；PCR反应体系为：25 μL mix，上、下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O补足至50 μL；PCR程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。扩增产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测,将扩增成功后的PCR产物送华大基因公司进行测序，其结果在NCBI基因数据库中进行Blast比对，并分析鉴定菌株的同源性。利用MEGA5软件构建系统发育树。

1.2.4 乳酸菌生长曲线和pH的测定 将鉴定出的纯菌株接种至MRS液体培养基中37 ℃厌氧培养，每隔4 h取样测其OD 600 nm的值，持续至24 h。每个样品重复3次取其平均值，将获得的数据绘制生长曲线。将-80 ℃保存的纯菌株活化2代后，接种至MRS液体培养基37 ℃厌氧培养，用pHS-3B精密酸度计测量不同时间段菌液的pH，每个样品做3次重复，将记录的数据绘制曲线。

1.2.5 乳酸菌耐酸实验 以pH 7.0的PBS缓冲液为基础，使用370 g/L盐酸将其调制为3.0，灭菌后按100 mL/L的接种量接入已活化2代的菌液，在37 ℃条件下分别取0、30、60、90、120 min通过平板计数法测定其活菌数，每组3个平行并取其平均数。

1.2.6 乳酸菌药敏试验 将培养24 h的乳酸菌液稀释至合适浓度后，取100 μL均匀涂布于MRS琼脂培养基表面，使用无菌镊子将不同的药敏片均匀的贴在培养基表面，每个平板放入4种抗生素药敏片。至于37 ℃生化培养箱内培养12 h～24 h，观察其耐药结果，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。每组做3个重复并通过结果判断标准参考《乳酸细菌现代研究实验技术》[7]。

2 结果

2.1 乳酸菌菌落与染色形态特征

对双峰驼十二指肠内分离出的4株乳酸菌革兰氏染色结果显示,B1、B2、B3、C1染色结果均为阳性，镜检除C1细菌形态为圆形外其余3株均为杆状，但B2的菌落形态对比其他3株较透明，B3虽然菌落形态为白色但其表面光滑度较B1、C1粗糙。根据其菌落形态特征、革兰氏染色结果及生理生化鉴定结果参考《细菌伯杰氏鉴定手册》初步判断B1、B2、B3为乳杆菌属，C1为乳球菌属。结果表明不同的菌株其菌落形态及其细菌形态也会存在差异(表1和图1)。

2.2 乳酸菌生化及16S rRNA PCR扩增鉴定结果

分离出的4株菌生理生化结果显示,4株乳酸菌的氧化酶、过氧化氢、明胶液化、硫化氢试验均为阴性，但4株菌对甘露糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等发酵结果为阳性(表2)。结果表明，这4株菌对葡萄糖、山梨醇、麦芽糖、蔗糖等都能发酵利用。参照《伯杰细菌鉴定手册》进行对照分析，初步判定为乳酸菌。

将4株菌的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带结果显示，其大小为1 500 bp左右(图2)。其结果与16S rRNA基因测序片段结果一致，将其基因测序结果通过NCBI的Blast进行比对,结果表明B1菌株与Lactobacilluscrispatus同源性100%、B2菌株与Lactobacillusjohnsonii同源性为100%，B3菌株与Lactobacillussalivarius同源性100%。C1菌株为Pediococcuspentosans同源性为99%。表明B1为卷曲乳杆菌、B2为唾液乳杆菌、B3为约氏乳杆菌、C1(为戊糖片球菌。采用MEGA 6.0软件构建的系统发育树见图3。

表1 乳酸菌菌落形态及革兰氏染色及镜检结果

A～B.戊糖片球菌；C～D.卷曲乳杆菌；E～F.唾液乳杆菌；G～H.约氏乳杆菌

表2 乳酸菌生化鉴定结果

M.DNA 标准DL 2 000;B1.卷曲乳杆菌;B2.唾液乳杆菌；B3.约氏乳杆菌;C1.戊糖片球菌

2.3 乳酸菌产酸和生长曲线的绘制

4株菌株的产酸结果显示，B1(卷曲乳杆菌)为3.96、B2(唾液乳杆菌)为3.91，B3(约氏乳杆菌)为4.2，C1(戊糖片球菌)为3.42。结果表明，D为戊糖片球菌，产酸程度较其他3株菌的产酸能力较强，其次唾液乳杆菌产酸程度次于戊糖片球菌,约氏乳杆菌产酸能力最差。卷曲乳杆菌在4 h～20 h处于对数生长，20 h之后从对数期处于稳定期的改变；唾液乳杆菌从4 h～18 h处于对数生长期，18 h之后处于稳定生长期；约氏乳杆菌从4 h之后开始到20 h处于对数生长期，20 h之后处于稳定生长期；戊糖片球菌从4 h～18 h处于对数生长期，18 h之后处于稳定期。表明4株菌株的最佳培养时间均为12 h～16 h之间。如图4所示，4株菌随着培养时间的增长产酸量增加，到最适生长时间时其产酸量最低。

A.卷曲乳杆菌;B.唾液乳杆菌；C.约氏乳杆菌；D.戊糖片球菌

A.卷曲乳杆菌;B.唾液乳杆菌；C.约氏乳杆菌；D.戊糖片球菌

2.4 乳酸菌耐酸试验

一般把能在pH 3.0环境下存在120 min作为体外初步筛选的初步条件。结果显示，只有戊糖片球菌、卷曲乳杆菌和唾液乳杆菌在pH 3.0的环境下120 min能存活，约氏乳杆菌在pH 3.0环境下，在30 min的时活菌数增加，到60 min的时活菌数显著下降，90 min和120 min时活菌数为0。表明了卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖片球菌对酸性环境的耐受性要高于约氏乳杆菌。

2.5 乳酸菌耐胆盐试验

乳酸菌在肠道内发挥其作用除受胃酸影响其存活外，肠道内胆盐也能改变其外膜通透性，所以其对肠道胆汁也应存在一定的耐受性。结果表明胆盐浓度>5 mg/mL时对4株菌的存活率影响较强，卷曲乳杆菌对胆盐的耐受性最强。其次为戊糖片球菌，唾液乳杆菌对胆盐的耐受性最弱。约氏乳杆菌对胆盐的耐受力最弱，其对酸的耐受力也最差(图5)。

2.6 乳酸菌对抗生素的耐药性

通过K-B纸片琼脂扩散法测量药纸片抑菌圈直径大小，依据《乳酸细菌现代研究》中的耐药实验中的判定标准，卷曲乳杆菌对四环素、青霉素、万古霉素、复方新诺明、庆大霉素、链霉素表现出耐药，对红霉素呈现在耐药和敏感之间，对氯霉素、氨苄西林敏感；唾液乳杆菌对氯霉素和青霉素敏感，链霉素处于敏感和耐药之间，而对四环素、红霉素、利福平、万古霉素、复方新诺明、庆大霉素耐药；约氏乳杆菌对红霉素敏感，四环素、氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、链霉素呈现耐药，而对氨苄西林、利福平处于耐药和敏感之间；戊糖片球菌对四环素、青霉素、利福平、庆大霉素和链霉素耐药，红霉素、氯霉素敏感，而对氨苄西林、万古霉素呈现中介(图6)。

3 讨论

乳酸菌与人畜胃肠道内疾病有着紧密的联系并对肠道疾病防御起着关键的作用，在疾病诊断方面能够利用肠道微生物群作为生物标志物来检测肠道疾病[18]。肠道菌群也被提出作为代谢紊乱的治疗靶标[19]。但是乳酸菌对肠道功能健全的维护必须要具有耐酸耐胆盐能力，双峰驼对比其他反刍动物没有瓣胃意味着食物在胃内储存的时间要高于其他哺乳动物，对胃酸的耐受性强[15-16]，本试验从双峰驼肠道内分离出唾液乳杆菌、约氏乳杆菌、戊糖小片球菌和卷曲乳杆菌这4株菌株，试验结果表明，这4株菌中卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖片球菌对盐酸的耐受能力强，能在pH 3.0的环境中耐受120 min,但约氏乳杆菌对盐酸的耐受能力低于其余3种菌株，在90 min和120 min的环境中菌株不存活。乳酸菌在肠道内发挥其益生作用，除了耐受胃内严酷的酸性环境外，还必须要承受胆盐的侵袭作用[20]。试验结果表明，卷曲乳杆菌对胆盐的耐受性强于其余3株菌，约氏乳杆菌对胆盐的耐受性最弱。乳酸菌经受胃酸和胆盐的特殊环境后才能在肠道发挥免疫调节、预防有害菌对肠道的损伤。通过耐酸、耐胆盐试验，结果表明卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖片球菌对胃酸和胆盐具有较好的耐受性，能够作为治疗肠道疾病的辅助药物的候选者。但随着近些年对抗生素的滥用，导致耐药菌菌株的出现，乳酸菌对抗生素的耐药作用是其成为新型治疗胃肠道疾病药物的关键因素。经对试验结果的数据比对发现，不同菌株表现出不同的耐药性，4株菌均对四环素、庆大霉素产生耐药性；卷曲乳杆菌对红霉素处于中介，唾液乳杆菌对红霉素表现为耐药，其余2株均为敏感状态；对氯霉素卷曲乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖片球菌均表现为敏感，但约氏乳杆菌却处于中介；除了唾液乳杆菌对青霉素表现出敏感之外其余3种菌对其耐药；约氏乳杆菌对利福平呈现中介，其余3株菌均为耐药表现；除戊糖片球菌对万古霉素处于中介，其余呈现耐药；卷曲乳杆菌和唾液乳杆菌对复方新诺明表现出耐药性，约氏乳杆菌和戊糖片球菌处于中介；卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌和戊糖片球菌对链霉素产生耐药性，唾液乳杆菌却对其处于中介。因此可以表明菌种的不同，可能会对受体以及药物的耐受性有着不一致的结果。

A.卷曲乳杆菌;B.唾液乳杆菌；C.约氏乳杆菌；D.戊糖片球菌

A.卷曲乳杆菌;B.唾液乳杆菌；C.约氏乳杆菌；D.戊糖片球菌；1.四环素;2.红霉素;3.氯霉素;4.氨苄西林;5.青霉素;6.利福平;7.万古霉素;8.复方新诺明;9.庆大霉素;10.链霉素

本试验从双峰驼十二指肠内分离出的唾液乳杆菌能够刺激免疫系统，通过调节Th1型过敏反应，来改善其过敏症状[21]。约氏乳杆菌有改善肥胖、减少胆固醇等功能[22]。本试验通过对双峰驼十二指肠肠道内乳酸菌的分离鉴定，为乳酸菌对胃肠道黏膜有益作用的进一步研究奠定了基础。