数字PCR技术在动物疫病诊断中的应用进展

郭宏伟，赵绪永，李华玮，张 震，马 辉，郑 鸣

(河南牧业经济学院，河南郑州 450011)

1985年，美国科学家Kary Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，使得在体外条件进行核酸片段的无限扩增成为可能，但是该方法存在操作繁琐、交叉污染风险较高等不足。1992年，实时荧光定量PCR的诞生不仅一定程度上避免了传统PCR技术的缺陷，还能够通过荧光信号、Ct值和靶基因的起始浓度3个参数实现对扩增产物或基因的表达水平进行定量分析。但是，由于实时荧光定量PCR技术的绝对定量依赖于Ct值和标准曲线，使得所谓的“绝对定量”在一定程度上只是相对的。同时，尽管实时荧光定量PCR在敏感性上能比传统PCR技术提高至少1个数量级，但是对于低拷贝的靶基因、模板差异倍数不大的情况下，实时荧光定量PCR技术的检测敏感性和精确度会受到限制。随着低丰度样品检测、基因突变检测应用需求的日益增加，真正可以实现绝对定量的数字PCR技术应运而生[1]。本文主要针对数字PCR的发展历史、技术原理、与实时荧光定量PCR相比的优缺点以及在动物疫病诊断中的应用等方面进行综述，以期为提升动物疫病分子诊断能力提供借鉴。

1 数字PCR的发展历史

1999年，美国约翰·霍普金斯大学的Vogelstein B等[2]首次提出了数字PCR(digital polymerase chain reaction)的概念，并在96孔板和384孔板上实现对结肠癌的致癌突变基因Kras进行了定量分析。但是此时的数字PCR方法是比较原始的、需要大量手工操作的劳动密集型技术，难以广泛应用[1]。随着微流体技术和纳米制造技术的进步，数字PCR技术也迎来了突破技术瓶颈的契机。2006年，Fluidigm公司利用其微流控技术的优势推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR平台，可将48个样品分布在770个微反应单元中。Quanta Life公司利用油包水微滴生成技术开发的微滴式数字PCR技术也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台。2011年Quanta Life公司被Bio-Rad公司收购，其微滴数字PCR平台更名为QX100TM型号继续在市场进行销售。Bio-Rad公司的微滴数字PCR平台也是目前我国应用比较广泛的一个品牌。2012年，Rain Dance公司推出的RaindropTM数字PCR设备将其原有的二代测序文库制备平台技术移植到数字PCR技术平台，适用于处理更大浓度差异的样品类型。2013年，Life technologies公司推出了Quant Studio 3D数字PCR系统，该系统采用高密度的纳升流控芯片技术，样品被均匀分配至20 000个单独的反应孔中，可以有效防止样品交叉污染，简化了操作步骤[3]。在我国《“十三五”国家科技创新规划》中，已经将“突破微流控芯片、单分子检测、自动化核酸检测等关键技术、开发全自动核酸检测系统”作为一项国家战略。近年来，我国的北京新羿生物科技有限公司、西安天隆科技有限公司、苏州锐讯生物科技有限公司等多家公司已经开始了数字PCR平台的研发工作，相信不久的将来市场上就会有国产品牌的数字PCR出现。

2 数字PCR技术原理

数字PCR的原理可以理解为分散成无数个独立反应单元的定量PCR，从而实现单分子意义上的绝对定量检测，也可以将数字PCR采用的策略简单地理解为对每个模板分子分别进行“单分子模板PCR扩增”。即将1个样本稀释并分成数百个甚至数百万个独立的反应单元，使得所有独立的反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的DNA模板分子，进而对所有独立的反应单元进行平行扩增。数字PCR采用终点定量的方法进行分析，即在扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号并采用泊松分布的统计学方法进行分析，就可以计算出原始样本的模板拷贝数[4]。

3 数字PCR的优缺点

数字PCR的优势主要体现在：数字PCR是一种绝对定量的PCR技术，与实时荧光定量PCR相比，其定量过程不需要依赖标准曲线，当在缺乏合适的参考物或校准物的情况下进行定量时，数字PCR的这一优势就愈发明显；数字PCR定量的精确性更高，但是当分析物中模板的浓度非常低时，会因为数字PCR反应体系中不同分区里模板的随机分布差异而引起其精确性降低[5-6]；数字PCR反应体系中，分析物的目的序列被分配到多个独立反应体系中，可以显著降低背景信号和抑制物(如SDS、EDTA和肝素等)对反应过程的干扰，基质效应大大降低。数字PCR的这一优势在检测环境样品和粪便样品时最为明显[3,7-8]。

数字PCR的不足主要包括：数字PCR检测的动态范围受到最大分区数的限制，对于模板浓度过高的样品需要预先对检测样品的模板进行适当的稀释；某些数字PCR平台的检测通量比实时荧光定量PCR低，且操作步骤更加复杂；某些数字PCR平台(如微滴数字PCR系统)在对反应体系分区和数据读取的时候存在引入污染的风险；除此之外，数字PCR使用过程中还需要专门的仪器和耗材，单次检测的成本明显比实时荧光定量PCR要高[7]。以Bio-Rad公司的QX200微滴数字PCR系统为例，其单次检测试剂和耗材的价格就高达180元人民币。昂贵的仪器和试剂耗材是目前阻碍数字PCR技术大范围推广的主要瓶颈。

4 数字PCR技术在动物疫病诊断中的应用

4.1 病毒检测

4.1.1 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 核酸类检测方法是目前非洲猪瘟诊断的主要方法，当检测含有较多量病毒的唾液、血液、组织等样品时，实时荧光定量PCR和等温扩增等核酸检测技术尚能够胜任，但是在检测饲料、食品、环境中微量的ASFV时，这些方法的敏感性就会存在一定的局限性。邬旭龙等[9]以ASFV的K205R基因作为诊断靶标设计一对特异性引物和TaqMan探针，建立了诊断ASFV的实时荧光定量PCR和微滴式数字PCR检测方法，该方法最低检测限为约20拷贝/反应体系，敏感性比使用相同引物探针的实时荧光定量PCR高10倍，具有良好的敏感性和特异性，由于文章发表时ASFV并未传入我国，作者未使用该方法对临床阳性样品的检测效果进行评估。原霖等[10]基于《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中的实时荧光定量PCR方法也建立了ASFV微滴数字PCR方法，该方法的最低检测限可以到达0.8 copies/μL，敏感性高于OIE推荐的实时荧光定量PCR，与猪瘟病毒(Classical swine fever，CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等猪常见的6种病毒均不发生交叉反应，而且重复性较好。使用该微滴数字PCR与OIE推荐的实时荧光定量PCR同时对78份临床病料进行检测，符合率可以达到100%。鉴于数字PCR的高敏感性和对不同样品中抑制成分的高耐受性，可以充分弥补实时荧光定量PCR在检测饲料、食品、环境样品中极低含量的ASFV时的不足，对于非洲猪瘟的防控具有重要意义。

4.1.2 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV) 原霖等[11]以PCV1的ORF1基因作为诊断靶标，建立了可以对该病毒准确定量的微滴数字PCR方法，该方法的最低检测限可达到7.8拷贝/20 μL，且与猪常见的病毒不发生交叉反应，在临床样品的检测中检测结果与实时荧光定量PCR结果一致。赵珊[12]以PCV2的ORF2基因为诊断靶标，建立了一种微滴数字PCR方法，不仅可用于猪血清和猪内脏组织等样品的检测，还可用于PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的测定。该方法的最低检测限为25拷贝/μL，其敏感性比实时荧光定量PCR高4倍，且不与PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV等猪易感的常见病毒发生交叉反应。使用上述两种方法对PCV2疫苗半成品中的病毒含量进行检测时，微滴数字PCR的检测结果与传统的TCID50方法测定的结果一致性更高。石磊等[13]针对PCV3的ORF2基因序列建立了用于该病毒检测的微滴数字PCR方法。该方法的最低检测限达到4.4拷贝/μL，且与PCV1、PCV2、PRRSV、APP、PRV、PPV和CSFV等常见猪病病原无交叉反应。在进行临床样品的检测时，PCV3微滴数字PCR方法比实时荧光定量PCR方法的灵敏度高10倍，其检测结果不仅与实时荧光定量PCR的定性结果一致，还能够对可疑的样本进行定量分析，从而实现确诊。除此之外，Liu Y等[14]和Zhang U等[15]也采用了微滴数字PCR平台建立了针对PCV3的高敏感性检测方法，最低检测限分别达到1.68拷贝反应体系± 0.29拷贝/反应体系和1拷贝/μL。鉴于这些PCV3的检测方法与前文中提到的类似，敏感性都优于相应的实时荧光定量PCR并有良好的特异性，在此不做展开论述。

在多重检测方面，Liu Y等[16]应用微滴数字PCR平台建立了同时可以PCV2和PCV3的二重微滴数字PCR方法，该方法对于PCV2和PCV3的最低检测限分别为2拷贝/μL和1拷贝/μL，比对应的二重实时荧光定量PCR技术要分别敏感3倍和10倍。在对300份临床样品进行检测时，对PCV2的检测结果微滴数字PCR方法与实时荧光定量PCR一致，而对PCV3的检测，微滴数字PCR方法多检测到了3份临床样品。由于PCV对养猪业的危害较大，以及新发现的PCV3引起人们的高度重视，在各种动物疫病的数字PCR检测方法中，PCV数字PCR检测方法的研究数量是最多的。这些单项和多重数字PCR的建立，也为未来PCV的实验室检测水平的提升提供了有力的技术保障。

4.1.3 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 为建立用于PRV检测的微滴数字PCR方法，陈亚娜等[17]以PRV的gB基因作为靶基因，建立了可对其准确定量的微滴数字PCR方法。该方法的最低检测限为6.1拷贝/μL，比实时荧光定量PCR方法的敏感性高25倍，且特异性良好。在对临床样品的检测中，该微滴数字PCR方法与病毒分离相比，符合率为97%。兰德松等[18]分别针对PRV的gD和gE基因，设计了2对特异性引物和探针，建立了分别针对PRV gD和gE基因的微滴数字PCR方法。该方法的对gD和gE基因的最低检测限分别为3.9拷贝/μL和2.3拷贝/μL，比相应的检测gD和gE基因的实时荧光定量PCR敏感性分别高10倍和5倍。同时，该方法的特异性好，批内和批间重复性的变异系数都较小，与实时荧光定量PCR方法的符合率为95.6%。值得注意的是，兰德松等建立的针对gD和gE基因的检测方法是两个独立的微滴数字PCR反应体系中进行的，如果能够进一步优化建立同时检测这两个基因的二重微滴数字PCR方法，将具有更高的应用价值。

4.1.4 其他动物病毒 Yang Q等[19]基于猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF7建立了微滴数字PCR方法，该方法比实时荧光定量PCR敏感10倍左右，对125份疑似感染PRRSV的临床样品的检测结果中，微滴数字PCR方法比实时荧光定量PCR多检测出9份阳性样品。

Wu X等[20]建立了用于日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)检测的微滴数字PCR方法，该方法的最低检测限可以达到2拷贝/20 μL，比实时荧光定量RT-PCR敏感100倍，且具有较好的特异性。在对103份猪临床样品的检测中，微滴数字PCR的阳性检出率比实时荧光定量PCR高了10.7%，这意味着该方法能够检测出更高效的对临床样品进行检测。

除目前已发表的上述用于检测动物病毒的数字PCR方法，中国动物疫病预防控制中心等单位也起草了《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式数字RT-PCR检测方法(T/CVMA6-2018)》《猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式数字RT-PCR检测方法(T/CVMA7-2018)》《动物A型流感病毒微滴式数字RT-PCR检测方法(T/CVMA8-2018)》和《猪圆环病毒1型微滴式数字PCR检测方法(T/CVMA9-2018)》《猪圆环病毒2型微滴式数字PCR检测方法(T/CVMA10-2018)》《伪狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法(T/CVMA11-2018)》等多个中国兽医协会的团体标准。这些团体标准的发布，说明数字PCR技术在动物疫病诊断中的重要作用正在得到整个行业越来越多的认可。

4.2 细菌检测

和病毒检测的数字方法相比，用于细菌检测的数字PCR的报道较少。石磊等[21]针对链球菌(Streptococcussuis，SS)中gdh基因的保守序列建立了可以对该细菌精确定量的微滴数字PCR方法，使用阳性质粒对该方法最低检测限测定的结果为2.69拷贝/μL。同时该方法也具有较好的特异性，与常见的病原菌如大肠埃希氏菌、沙门氏菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌以及猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒等均无交叉反应。

为了建立高敏感性的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)检测方法，石磊等[22]针对该细菌特异性基因apxⅣ的保守序列建立了微滴数字PCR方法，其最低检测限为153.8拷贝/μL，比实时荧光定量PCR的敏感性提高两倍，与其他常见猪病原无交叉反应。110份临床样品的检测中，该方法与实时荧光定量PCR检测结果的Kappa系数为0.952 9，表明这两种方法检测结果的一致性高，并且微滴数字PCR可对实时荧光定量PCR无法判定的可疑样本进行定量分析。

石磊等[23]学者还基于副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)中OMP P2基因的保守序列建立了可对该细菌准确定量的微滴数字PCR方法。该方法的敏感性高，最低检测限可达到2.65拷贝/μL，高于实时荧光定量PCR方法。特异性方面，该微滴数字PCR方法与多种猪常见的细菌性和病毒性病原均无交叉反应。通过对临床样品的检测结果表明，该微滴数字PCR方法具有敏感性高、特异性好的优点，其检出率高于实时荧光定量PCR方法。

除此之外，郭瑛等[24]基于布鲁氏菌的IS711插入基因的保守序列还建立了针对布鲁氏菌检测的微滴式数字PCR方法。通过使用该方法对从一名在布鲁氏菌病急性期感染期且经过抗生素治疗6周后仍有临床症状的患者的血清中检测到了布鲁氏菌的核酸，而对该患者的血液进行分离培养也显示为阳性。鉴于血清中数字PCR检测结果与血液样品分离培养结果吻合，可以看出数字PCR技术在布鲁氏菌病患者治疗效果判定中具有一定的应用价值。由于布鲁氏菌是一种人兽共患病原，该方法在动物布鲁氏菌病的诊断中，尤其是在检测大罐奶样品、养殖场环境样品等病原含量较低的样品时也具有一定的应用价值。

4.3 寄生虫检测

近年来，寄生虫病数字PCR诊断方法的研究也较多，但是绝大多数研究是针对人类易感的寄生虫病原的检测[25]。在动物疫病相关寄生虫的数字PCR检测技术中，研究最多的日本血吸虫(Schistosomajaponicum)。Weerakoon K G等[26]基于日本血吸虫的逆转录转座子sjR2和nad1基因建立了一种用于日本血吸虫核酸检测的双重微滴数字PCR方法。该方法的最低检测限可以达到0.05 fg模板DNA，远低于单个日本血吸虫虫卵的总DNA含量(约50 pg)。该方法与曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)、猪带绦虫(Taeniasolium)、肝片吸虫(Fascioliasishepatica)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepisdiminuta)和细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)均无交叉反应。VAN Dorssen C E等[27]采用数字PCR方法和实时荧光定量PCR方法对山羊粪便中的日本血吸虫虫卵的核酸进行检测，结果数字PCR检测的阳性率为46.4%，而实时荧光定量PCR仅为6.9%。这说明数字PCR技术可以作为日本血吸虫诊断和检测的重要技术手段，尤其是流行率较低的地区。相比于低敏感性的显微镜观察虫卵法和低特异性的血清学检测方法，数字PCR方法可以对多种宿主样品(如粪便、血清、尿液和唾液)中微量的寄生虫DNA进行检测，极大地提高了检测的敏感性和准确性。数字PCR技术的出现为提高寄生虫病诊断水平提供了必要的技术手段。

5 展望

作为最新一代的PCR检测技术，数字PCR相比实时荧光定量PCR有着无以比拟的巨大优势，比如更高的敏感性和准确度，能够实现绝对定量等。目前该技术已经在医学诊断、转基因定量分析、物种鉴定、食品安全等越来越多的领域得到应用。尽管由于较高的成本和比较繁琐的操作步骤使得数字PCR目前还无法完全替代实时荧光定量PCR方法，但是随着技术的进步和商品化的发展，相信不久的将来，数字PCR技术一定能够在动物疫病诊断领域发挥越来越重要的作用。