猪繁殖与呼吸综合征病毒膜融合机制研究进展

李 睿，乔松林，张改平

(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称猪蓝耳病，临床症状为妊娠母猪流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪呼吸道疾病等[1]。PRRS病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒[2]，危害巨大，多年来一直是兽医和病毒学领域的重点研究对象。然而，由于PRRSV具有独特而且复杂的感染机制，目前对其防控并未取得显著效果[3]。作为具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主细胞需进行病毒囊膜与宿主细胞靶膜融合(membrane fusion)这一关键步骤。因此，追踪PRRSV膜融合最新研究进展将为深入理解PRRSV致病机制奠定基础，并为防控PRRS提供新的思路和策略。

1 囊膜病毒及其膜融合机制

囊膜病毒(enveloped viruses)是一类在由核酸(DNA或RNA)和蛋白质外壳(capsid)组成的核衣壳(nucleocapsid)外具有脂质双分子层囊膜结构(envelope)的病毒[4]。因缺乏复制必需的基本系统，病毒自身不能增殖，必须感染宿主细胞，将核酸侵入宿主细胞内借助宿主细胞的复制系统增殖新的病毒从而进行传播[5]。囊膜病毒感染宿主细胞的关键步骤是病毒囊膜与宿主细胞膜(plasma membrane)或胞内体(endosomes)膜等靶膜的融合[6]。这一过程是由病毒膜融合蛋白(fusion protein)介导，宿主细胞受体结合、低pH刺激、蛋白酶切割等诱导和激发的复杂过程[7]。根据囊膜病毒膜融合蛋白在囊膜表面的结构、排列及膜融合时构象变化等的不同，目前可将囊膜病毒膜融合蛋白分为3类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[8]。Ⅰ型膜融合蛋白，以副流感病毒(Parainfluenza virus)为例，富含α-螺旋结构(α-helix)，在电子显微镜下呈现明显的“纤突”或“刺突”，具有融合肽(fusion peptide)，膜融合完成后变构形成稳定折叠的三聚体发夹结构(trimer-of-hairpins)；Ⅱ型膜融合蛋白，以蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)为例，富含β-片层结构(β-sheet)却不形成“纤突”或“刺突”，具有融合环(fusion loop)，但最终膜融合完成后仍会形成三聚体发夹结构；Ⅲ型膜融合蛋白，以水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)为例，兼具α-螺旋和β-片层结构，目前这类病毒膜融蛋白研究还不全面[9]。

研究囊膜病毒膜融合机制具有重要的科学意义和应用价值，针对病毒膜融合蛋白可制备高效特异性疫苗或针对病毒膜融合过程研发新型抗体类和小分子类抗病毒药物等[10-11]。例如，根据人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)膜融合蛋白设计的多肽类抑制药物恩夫韦肽(enfuvirtide)已获得美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准应用于临床治疗并取得了显著的抑制病毒感染效果[12]。近期，复旦大学陆路/姜世勃等发现的新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)膜融合抑制剂针对新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)治疗具有较好的临床应用前景[13]。

2 PRRSV与膜融合

PRRS于20世纪80年代末90年代初分别在美洲和欧洲报道[14]。自此该病在全球范围内广泛传播，目前已成为威胁全球养猪业最主要的传染病之一，造成了巨大的经济损失[15]。据估计PRRS每年给美国养猪业造成近6.5亿美元的经济损失[15]。自1995年我国首次报道PRRS以来，该病在国内长期流行[16]。考虑到国内养殖规模和养殖水平，PRRS对我国养猪业造成的经济损失应远大于美国。特别是2006年，我国大面积暴发和流行的以高热、高发病率和高死亡率为特征的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，对国内养猪业造成了前所未有的打击[17-18]。从2013年起，由NADC30样(NADC30-like)毒株引起的PRRS在国内出现并广泛流行，引发了新的关注[19-21]。

PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Porartevirus)[22-23]。PRRSV分离毒株分为2个基因型，即PRRSV-1和PRRSV-2[24]。PRRSV基因组约15 kb，含有至少10个开放阅读框(open reading frames，ORFs)[22]。其中，ORF1(ORF1a和ORF1ab)编码RNA依赖的RNA聚合酶等非结构蛋白(non-structural proteins，Nsps)；ORF5-7分别编码囊膜糖蛋白(glycoprotein，GP)GP5、基质蛋白(matrix protein，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)，它们是PRRSV的主要结构蛋白；ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a分别编码囊膜糖蛋白GP2a、GP2b(又称E)、GP3、GP4 和GP5a，它们是PRRSV的次要结构蛋白[25]。GP5、M、GP2a、GP2b、GP3、GP4 和GP5a分布在PRRSV囊膜表面[26]。

猪是PRRSV目前唯一已知的宿主，PRRSV在猪体内主要感染单核/巨噬细胞，如猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)[27]。PRRSV在体外还感染非洲绿猴肾上皮细胞系MA-104及其衍生的MARC-145细胞系等[28]。研究证实PRRSV是由宿主细胞表面必需受体CD163介导，通过网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-mediated endocytosis，CME)入侵宿主细胞的[29-33]。作为一种具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主细胞需进行膜融合这一关键步骤。但是，目前国内外在PRRSV膜融合机制研究领域存在很多空白，包括病毒必需受体CD163在PRRSV 膜融合过程中的具体作用机理，除必需受体CD163外是否还存在其他宿主因子(如低pH、蛋白酶)甚至是辅助受体参与PRRSV膜融合及其作用细节，在PRRSV结构蛋白中参与膜融合的囊膜蛋白是哪个(些)及其参与膜融合详细机制等。这些问题严重阻碍了人们对PRRSV致病机理的全面认识及对PRRS的有效防控。

3 PRRSV膜融合机制最新研究进展

近年来，随着研究深入，国内学者率先在PRRSV膜融合领域取得进展。

2019年中国农业大学杨汉春教授、韩军教授研究团队利用亲脂性染料R18标记HP-PRRSV毒株JXwn06及其缺失突变株，通过激光共聚焦显微术(laser confocal microscopy，LCM)发现病毒非结构蛋白nsp2高变区(hypervariable region)323-521位氨基酸缺失影响了PRRSV膜融合，揭示了该蛋白在PRRSV感染中的新功能[34]。

本研究团队近期利用病毒囊膜亲脂性染料DiD标记PRRSV-2经典毒株BJ-4通过LCM监测到PRRSV在感染MARC-145细胞和PAMs早期(45 min)发生膜融合；然后利用亚细胞定位标志物证实PRRSV在以Ras相关蛋白11(Ras-related protein 11，Rab11)为标志的循环胞内体(recycling endosomes)发生膜融合；进一步通过显性失活/组成型激活(dominant negative/constitutive active，DN/CA)突变体、特异性抑制剂(inhibitors)、RNA干扰(RNA interferece，RNAi)等验证Rab11-recycling endosomes中低pH和组织蛋白酶E(cathepsin E)在PRRSV膜融合过程中发挥重要作用；通过实时定量PCR试验(real-time PCR，PCR)测定PRRSV ORF7复制、蛋白印迹法(Western blot，WB)测定PRRSV N蛋白翻译、病毒滴度试验(50% tissue culture infectious dose，TCID50)测定PRRSV子代病毒等证实阻碍PRRSV膜融合过程会影响病毒感染；最后经病毒蛋白特异性抗体检测发现PRRSV膜融合过程中其囊膜糖蛋白GP5被cathepsin E切割[35]。这一研究在国内外首次揭示了PRRSV膜融合细节，加深了人们对PRRSV致病机制的理解；更重要的是，该研究鉴定出的低pH、cathepsin E、GP5可作为抗PRRSV药物和疫苗的新靶标。

4 结语

综上所述，虽然近年来国内学者在PRRSV膜融合机制取得了研究进展，但是PRRSV膜融合领域仍存在许多空白值得深入研究：病毒必需受体CD163在PRRSV膜融合过程中的具体作用机制;除Rab11、低pH、cathepsin E外是否还存在其他宿主因子参与PRRSV膜融合及其作用机理;PRRSV GP5蛋白是否作为病毒膜融合蛋白等。基于已取得的进展，持续深入研究PRRSV膜融合机制将为防控该病毒提供新的思路和策略，具有重要的科学意义和应用前景。