新城疫疫苗研究现状

孟令宅，庞洪泽，赵 卓，赵 款,2﹡，袁万哲,2﹡

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001，2.河北省兽医生物技术创新中心,河北保定 071001，3.北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京 102629)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种烈性传染病，临床主要表现为高热、呼吸困难、下痢、肠道黏膜出血，并伴有一定的神经症状。新城疫是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，对我国养禽业造成严重的经济损失[1-3]。新城疫病毒于1926年在印度的爪哇和英国的新城被发现，之后在全世界广泛流行[4]。根据对鸡的致病性，NDV分为强毒株、中等毒株以及弱毒株[5-7]。研究表明，F蛋白的112-117裂解位点是NDV致病性的主要分子决定因素[8]，强毒株的序列通常为112R/K-R-Q-R/K-R-F117，可被全身组织细胞内的裂解酶裂解，可以引起全身组织器官的感染；弱毒株的序列通常为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117，其中112位点的G及117位点的L使得F蛋白对细胞内裂解酶不敏感，而更依赖于呼吸道及肠道的细胞外蛋白酶裂解，鸡感染后只表现出一些轻微的呼吸道及肠道症状。NDV只有一个血清型，根据其基因组长度可分为两大分支，即ClassⅠ与ClassⅡ。ClassⅠ一般为低毒力或无毒力的毒株，多从水禽中分离；历史上引起全世界范围内新城疫4次大流行的毒株均属于ClassⅡ分支，目前该分支已发现至少包含18个基因型[9]，我国鸡群中主要流行的是ClassⅡ中的基因Ⅶ型强毒株，优势亚型为Ⅶd和Ⅶe[10]，各基因型之间不能提供较好地交叉保护。由于疫苗免疫压力下，新城疫常表现为非典型临床症状，同时易与其他病原发生混合感染，如大肠埃希氏菌、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒等，不仅增加了临床的诊断难度，还造成紧急免疫接种失败[11]。非典型新城疫使得传统疫苗受到挑战，现有疫苗无法提供完全保护，应迫切开发新型疫苗来应对新城疫的防控。

1 病原分子特征

NDV为副黏病毒科禽腮腺炎病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒，病毒粒子呈球形，直径为150 nm～250 nm，目前已知的NDV基因组长度有3种,即15 186 nt、15 192 nt和15 198 nt[12-14]。NDV的复制严格遵循“六碱基原则”，即只有在基因组大小为6个核苷酸的倍数时才能进行有效复制。NDV基因组编码6种病毒结构蛋白[15]，分别为核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及依赖RNA的RNA聚合酶(L)。NDV基因组3'端有长为55 nt的引导序列，5'端有长为114 nt的尾随序列，两端的序列存在广泛的碱基互补现象，为病毒的重要调控区。内部蛋白NP、P和L可形成核糖核蛋白复合物(RNP)，该复合物是转录模板也是翻译模板。此外，P基因还可通过RNA编辑机制编码产生非结构蛋白V和W[16],可防止NP蛋白对其他蛋白的“非法”衣壳化。M、F和HN为病毒的外部蛋白，F蛋白和HN蛋白是决定NDV毒力的两个重要蛋白，其中F蛋白为NDV表面糖蛋白，可介导与宿主细胞的融合，HN蛋白是一种多功能蛋白，可根据其多肽的长度分为HN616、HN577及HN571等，其功能包括识别宿主细胞受体，去除受体，防止自组装以及与F蛋白相互作用促进融合[17-18]。M蛋白位于囊膜内侧面，在病毒RNA的合成调控和感染性粒子的组装方面起着重要作用，M蛋白还是病毒脂质囊膜内表面的支持物，能够维持病毒结构的完整性[19]。

2 传统疫苗

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗是将病毒灭活之后与相应佐剂按一定比例混合制备的疫苗，最为常见的是油乳剂灭活疫苗，灭活疫苗安全性高，无毒力返强风险，可诱导机体产生强烈的体液免疫应答。目前，我国审批通过的灭活疫苗毒株主要包括La Sota株、Ulster 2C株、A-Ⅶ株以及相应的多联疫苗株等。白军等[20]使用灭活的La Sota疫苗免疫SPF鸡，结果表明当NDV HI ≥ 4 log2时，攻毒保护率为80%；NDV HI≥5 log2时，保护率可达100%。近年来，由于NDV出现不同的基因型，且不同基因型之间存在较大抗原性差异，研究人员对新城疫灭活疫苗的研究主要集中在不同基因型的病毒多价苗、新城疫病毒与其他病原多联苗等方面。刘长清等[21]用鸡新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(aSG10株+G株)免疫鸡群，免疫后2周，NDV HI平均抗体水平可达10.9 log2，接种4周达到峰值11.0 log2，取得了良好的免疫效果。但灭活疫苗在使用过程中也存在一些问题，例如矿物油的副作用对机体的损害较大，不同免疫剂量组差异显著，不能诱导细胞免疫等缺点和不足。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗通常是用某些具有良好免疫原性的自然弱毒株或者经过人为改造致弱的毒株增殖培养后制成的疫苗。接种后疫苗毒能在体内复制，可同时诱导机体的体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫。我国审批通过的弱毒疫苗毒株主要包括Ⅰ系(Mukteswar株)、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F株)、Ⅳ系(La Sota株)、Clone-30株及耐热毒株V4等，尚无基因Ⅶ型的弱毒疫苗株。其中Ⅰ系苗属于中等毒力疫苗株，不适用于雏鸡和产蛋鸡的免疫，一般用于日龄较大的青年鸡的免疫，免疫后鸡产生抗体较快，持续时间可为3周～5周。Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系苗毒力均低于Ⅰ系株，可采用滴鼻、点眼、喷雾、饮水等多种方式进行免疫。但弱毒疫苗在临床生产应用中也存在一些风险和缺点，如免疫应激、易受饲养环境影响、存在毒力返强等风险。仇旭升等[22]通过分析基因Ⅲ型新城疫强毒分离株Js/7/05/Ch和JS/9/05/Go与中等毒力疫苗株Mukteswar的亲缘性关系，发现2株强毒分离株与Mukteswar的全基因组核苷酸同源性均为99.7%，氨基酸同源性为98.8%～99.8%，然而鸡胚平均致死时间(mean death time，MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index，ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(intravenous pathogenicity index，IVPI)均显著强于Mukteswar疫苗株，推断分离株JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go是由疫苗株Mukteswar自然进化而来的返强毒株，所以需要进一步研制新型疫苗来更好地控制ND流行。

3 基因工程疫苗

3.1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是利用原核或真核表达载体体外高效表达NDV的保护性抗原基因，并将获得的重组蛋白辅以佐剂制成的疫苗。王兴龙等[23]将F基因插入到pFastBad质粒中，利用杆状病毒表达系统制备了亚单位疫苗株，免疫后可以产生较好的保护效果，能抵抗新城疫病毒强毒的攻击；Khulape S A等[24]将编码F基因的重组质粒(pcDNA3.1-F)和表达F基因的重组蛋白(pcDNA3.1-F-protein)联合后制备亚单位疫苗，同时设置重组质粒(pcDNA3.1-F)或重组蛋白(pcDNA3.1-F-protein)单独免疫组，3组分别免疫14日龄SPF鸡后发现，pcDNA3.1-F组、pcDNA3.1-F-protein组和联合组的免疫保护率分别为66.6%、83.3%和91.6%，联合组免疫机体后，通过MHCⅠ和MHCⅡ途径可以迅速诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖活化，启动机体的体液免疫和细胞免疫应答，可更好的实现全面保护。亚单位疫苗在预防和治疗方面有较大优势，但在制备工艺、免疫剂量上成本较大，因此目前较难得到广泛应用。

3.2 重组活载体疫苗

利用疱疹病毒、痘病毒等作为载体，插入新城疫病毒的保护性抗原基因构建的重组活载体病毒疫苗，试用于临床免疫，在被接种鸡体内抗原得到大量表达，能够诱导机体产生免疫应答，使鸡得到免疫保护，这就是重组活载体疫苗[25-26]。相比传统疫苗，重组活载体疫苗有一定优势，如免疫机体后，仅会产生针对病毒某一结构蛋白的单一抗体，易于区分野毒感染和疫苗免疫；其次，可以在载体插入其他病原的保护性抗原基因，达到同时预防多种疾病的目的。智海东等用共表达新城疫病毒F基因和鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组痘病毒(rFPV-gB-F)，对28日龄SPF鸡进行免疫攻毒试验，结果表明攻毒保护率均在80%以上，取得了良好的免疫效果。传统疫苗可以减少感染动物的死亡率，抑制组织脏器的严重病变，但免疫动物往往表现排毒散毒，而重组活载体疫苗可以显著减少动物的排毒散毒，降低其他动物的感染风险，所以有研究者将二者联合起来，使其发挥各自的优势。Palya V等[27]将表达F蛋白的火鸡疱疹病毒重组载体活疫苗rHVT-ND免疫21日龄SPF鸡，同时设置与传统疫苗联合免疫组，结果表明联合免疫组的保护率可达95%以上，免疫持续期可以达72周，排毒量显著减少。活载体疫苗所表达的抗原以半复制的方式递呈给宿主，可同时诱导体液免疫和细胞免疫应答，还可以与传统疫苗联合使用，便于开发多价苗和多联苗，是未来的疫苗研究热点之一。

3.3 新城疫病毒载体疫苗

NDV的P基因和M基因之间可嵌入3 kb左右的外源基因片段[28]。NDV作为载体具有一些优势。首先，NDV为负链RNA病毒，整个复制过程在细胞浆中进行，不产生DNA，消除了与宿主细胞DNA整合的可能性，安全性高，遗传稳定性好。第二，呼吸道和消化道为多种禽类病原微生物感染宿主的主要途径，而NDV不仅能够在其中较好的增殖，还可以诱导机体产生强烈的细胞和体液免疫应答。第三，NDV还可以在多种细胞系及鸡胚中增殖并能达到很高的病毒滴度，便于大规模生产和应用。第四，NDV还可以诱生干扰素，以其为载体制备的疫苗可用于紧急免疫。Nagy A等[29]以La Sota疫苗株为骨架，构建表达禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)的重组病毒，其在鸡胚上有较高的生长滴度，免疫鸡后抗体水平H9 HI可达8.3 log2，NDV HI可达7.5 log2,可以抵抗致死剂量NDV和AIV的攻击。Tian K Y等[30]构建了1株可以表达禽腺病毒4型fiber-2基因的重组NDV，用100 μL(107EID50)的免疫剂量免疫，然后分别用105TCID50的禽腺病毒4型强毒CH/HNJZ/2015株和104EID50的新城疫病毒强毒F48E9株进行攻击，存活率均为100%，取得了良好的免疫效果。Chen X等[31]利用反向遗传学拯救出表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组新城疫病毒rNDV/p72，通过鸡胚传代10次仍具备良好的增殖特性，将rNDV/p72免疫小鼠后，产生了高滴度的IgG抗体，同时可促进T细胞增殖活化，IFN-γ和IL-4表达水平上升。

3.4 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是利用异源宿主系统表达一种或几种病毒结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。VLPs可刺激产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，同时能作为载体表达其他抗原，也可设计成为区分野毒感染与免疫接种的疫苗株，具有很好的发展前景[32]。Pantua等证实NDV的M蛋白是促进病毒出芽和释放的主要驱动力，在HN、F和NP的参与下，可以形成与真实病毒粒子大小、形态、功能类似的VLPs。Qian J等[33]发现NDV VLPs通过上调MHCⅡ和共刺激分子以及通过TLR4/NF-κB途径促炎的细胞因子来有效激活DC，进而起到更好的免疫效果。此外，NDV VLPs还可诱导DC成熟和迁移，激活CD4+T细胞，从而诱导IFN-γ和IL-4水平上的升高。Wu X等[34]将鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)S1蛋白和新城疫病毒F蛋白分别连于IBV S蛋白的跨膜区和胞外域，构建了新型嵌合传染性支气管炎-新城疫(IB-ND)病毒样颗粒(VLPs)疫苗，用不同剂量(50、75、100 μg)免疫SPF鸡后，分别用IBV和NDV强毒攻击，结果显示当免疫剂量为100 μg 时，保护率均为100%，且组织和泄殖腔中病毒RNA水平明显降低，表明嵌合IB-ND VLP具有良好的免疫原性，免疫动物后可以抵抗强毒攻击。尽管VLPs具备安全、稳定、免疫原性好以及不依赖鸡胚等优势，但在生产成本、表达量上还是存在一定的缺陷，因此，真正运用到临床生产，还需要进一步优化生产成本及制备工艺。

3.5 核酸疫苗

新城疫核酸疫苗的原理是将表达F或HN基因的真核表达载体导入机体，使其在体内大量表达，激发特异性免疫应答。李楠等[35]将稳定表达NDV HeB02株F基因的真核表达质粒pSV-F采用活体电击法免疫3周龄SPF鸡，以100EID50剂量攻毒后，免疫组未分离到病毒；姜永厚等构建了共表达IL-2、NDVF基因的重组质粒，免疫SPF鸡后，然后用NDV强毒株F48E9攻击，结果共表达重组质粒组的免疫保护率显著高于单独接种F基因组，证实所克隆的IL-2有免疫增强作用，表明核酸疫苗可以通过优化质粒基因来增强抗原递呈细胞的识别能力，进而提高疫苗的免疫效果；Zhao K等[36]将不同数量的C3d插入表达NDVF基因的真核表达载体PVAXI中，使用N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子为佐剂，细胞转染试验表明，pVAXI-F-C3d6表达量最高，通过滴鼻途径免疫产生了高水平的IgG和sIgA，使用NDV强毒株F48E9攻击，保护率在80%以上，表明氯化铵壳聚糖纳米粒子可作为有效的免疫佐剂，在疫苗和药物方面有广阔则应用前景。核酸疫苗具有免疫应答持久、无散毒和毒力返强的危险，不引起宿主自身免疫病等诸多优点，但也存在免疫应答较弱、容易引起免疫耐受、价格昂贵的缺点和不足，真正运用到临床实际应用还需要进一步研究和探索。

4 展望

目前，国内外一直广泛应用的La Sota、Clone30等疫苗株仍然是上世纪50年代流行的基因Ⅱ和Ⅰ型毒株，不能有效防控基因Ⅶ型毒株，导致临床上多见非典型新城疫与高抗体家禽发生NDV感染。灭活疫苗存在副作用较大，不能诱导细胞免疫应答等缺点，弱毒活疫苗存在毒力返强风险、易与其他病原菌混合感染；亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗与核酸疫苗虽然在免疫原性、安全性、刺激细胞免疫应答等方面有一定优势，但在生产成本、表达量等方面还存在一定缺陷。利用反向遗传技术构建的新城疫病毒载体疫苗株可以提供较高的保护率，但目前尚无针对新城疫的标记疫苗株，未来研发重点是研发针对该病的表位缺失或基因缺失的标记疫苗毒株上，同时在已建立的反向遗传操作平台的基础上，研发不同基因型的多价苗、多联苗。此外，使用鸡胚生产，成本较高。对于细胞培养NDV的技术尚未取得实质性突破，应进一步优化生产工艺，以研制出安全、高效、价格低廉、生产工艺简单、适用的NDV疫苗，使我国基因Ⅶ型新城疫得到有效防控。