动物源大肠埃希氏菌耐药机制及中药对其耐药性消减的研究进展

王雅丽，张灵枝，李志君，韩晓霞，韩 洋，张为民*，卿素珠*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河南省鹤壁市第二中学，河南鹤壁 458000)

细菌耐药性已然成为世界范围内广为关注的公共卫生问题。意大利相关机构监测结果显示，2002年-2011年期间所分离的442株仔猪腹泻源大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)对恩诺沙星、氟苯尼考和头孢喹肟的耐药率至少增加了42%，且耐6种以上抗菌药物的多重耐药菌株数呈显著增加趋势[1]。Fazel F等[2]对来自伊朗不同地区的奶牛场70株临床乳腺炎奶牛源大肠埃希氏菌进行分析，发现47.1%的菌株至少携带一种氨基糖苷类抗性基因，62.9%菌株带有多种耐药基因。Radwan A等[3]从埃及肉鸡养殖场中分离的98株大肠埃希氏菌呈100%多重耐药性，其中对丁胺卡那霉素、环丙沙星等药物的耐药性在90%以上。Yu Z N等[4]对中国11个省规模化奶牛场乳腺炎病例大肠埃希氏菌分离株进行耐药性差异调查，发现对青霉素、林可霉素和苯唑西林耐药最为严重，而且所有菌株至少对3种抗菌药物具有耐药性。上述报道说明大肠埃希氏菌耐药已成普遍现状。大肠埃希氏菌耐药性的增强和多重耐药细菌的增多不仅仅导致临床疾病难以治疗，而且细菌间耐药基因的转移还会使细菌耐药性广泛蔓延。在畜牧养殖生产中大规模使用治疗性和亚治疗性抗生素使动物肠道微生物群中的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)产生高选择性的压力，并产生了大量含抗生素的动物粪便，将粪便施用于农田，而导致抗药性细菌在农作物、动物和人类之间传播[5]。Guo T等[6]通过对灌溉猪粪2年的土地表层的土壤进行分析，发现长期施肥会造成重金属污染以及抗生素残留，经分析发现ARGs与土壤中抗生素-重金属污染的程度呈正相关。

肠杆菌科对抗生素的高耐药性使得研究消减其耐药性的生物学措施成为近年各国研发的热点，而针对中药在这方面的相关研究也愈来愈得到关注。在畜禽养殖和疫病防治方面也进行了积极的探索，如黄芩苷(baicalin)能够降低链霉素(25.0%)、环丙沙星(19.6%)和青霉素(12.5%)等抗菌药物对从乳汁中分离出的大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)[7]；酸藤果(Embeliaribes)提取物和海藻(seaweed)提取物与抗生素联合使用都能够显著抑制大肠埃希氏菌生长，降低其耐药性[8-9]。本文就近年来国内外在动物源大肠埃希氏菌耐药机制及中药对其耐药性消减作用方面的研究进展进行综述。

1 大肠埃希氏菌耐药机制

细菌耐药机制复杂，往往是多种耐药机制同时存在或者协同作用。研究表明，动物源大肠埃希氏菌的耐药性产生主要涉及质粒介导、靶位点改变、产生作用于抗生素的酶、药物渗透障碍、形成生物被膜等5个方面。

1.1 质粒介导

细菌耐药基因是决定耐药表型的重要因素，通过自身基因突变和从外界两种方式得到，其主要的传播方式是质粒介导。质粒是除了染色体之外能自我复制的DNA环，可以携带一种或多种耐药基因，可通过转化等多种方式在细菌间进行转移，从而增强细菌的耐药强度、加速耐药性的扩散。自2015年发现由质粒介导的黏菌素抗药性基因(mobile colistin resistance,mcr-1)以来，已经先后在多种肠杆菌科、食品和动物以及人类中都检测到相同mcr-1基因[10]，它不仅能够在肠杆菌科的其他流行株内转移，而且动物源大肠埃希氏菌中mcr-1携带率明显高于人源携带率，表明耐药质粒传播导致的隐患很大，抗性基因很可能起源于动物再传播给人类。

1.2 靶位点改变

青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)是β-内酰胺类抗生素与细菌作用的靶标酶，具有高度保守的催化活性，参与细菌细胞壁肽聚糖(PG)的交联合成，药物与PBPs结合后，阻碍细胞壁形成致细胞溶解而细菌死亡[11]，PBPs结构改变、表达减少等异常现象是大肠埃希氏菌对β-内酰胺类产生耐药性的重要原因。喹诺酮类药物通过与细菌的DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ结合形成稳定复合物，导致细菌染色体断裂干扰转录来抑制菌体正常生长，编码DNA螺旋酶的GyrA和拓扑异构酶Ⅳ的ParC基因突变是导致大肠埃希氏菌对喹诺酮耐药的主要原因。

1.3 产生作用于抗生素的酶

大肠埃希氏菌可通过产生使抗生素结构破坏的酶，导致抗生素活性降低或失去活性而表现细菌耐药性。第一类是β-内酰胺类酶(β-lactamase)，大肠埃希氏菌通过产生β-内酰胺类酶以水解β-内酰胺类抗生素的活性结构导致药物失去抗菌活性，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)和新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)的存在是导致大肠埃希氏菌对β-内酰胺类抗生素不敏感的主要原因。第二类是氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside modifying enzyme,AMEs)，包括N-乙酰转移酶(AAC)、O-核苷酸转移酶(ANT)和O-磷酸转移酶(APH)，通过共价修饰药物上的特定氨基或羟基来灭活氨基糖苷类抗生素，从而导致细菌耐药。第三类是四环素钝化酶(Tet(X4))，在抗生素的压力下产生的由tetX基因编码的通过降解四环素使其失去活性的酶[12]。

1.4 药物渗透障碍

药物渗透障碍主要分为2种，其一是改变细胞膜通透性，减少药物进入菌体的浓度;其二是大肠埃希氏菌存在主动(能量来源为ATP水解或者质子驱动)识别和泵出自身代谢废物以及菌体环境中的毒性化学物质的蛋白外排泵(efflux pump,EP)系统，其过程经膜内转运蛋白、外膜通道蛋白及二者间的辅助蛋白的相互作用，直接减少到达作用靶位的药量，从而阻止药物发挥杀菌或抑菌功能。AcrAB-TolC系统是大肠埃希氏菌常见的一种外排系统，由acrB基因编码的转运子、acrA编码的连接AcrB到质膜的两种融合蛋白以及TolC外膜通道组成，EP活性受转录调节因子MarA、MarB、MarR和应激蛋白SoxS和Rob的调控，表达基因的过度上调和突变都会增大药物的不敏感性，此外在酸性(pH 5)条件下，活性明显更强[13]。

1.5 形成生物被膜

生物被膜(bacterial biofilm,BF)是微生物由其分泌的多糖蛋白复合物固着于各种表面、包裹群体菌落形成的聚集膜状物，是保护细菌定植和入侵机体的重要机制。复杂的膜状结构使细菌一直处于低代谢水平并减弱了抗生素的渗透程度，导致抗生素不能杀灭深层菌群，同时低水平的抗生素持续作用会增加大肠埃希氏菌的药物耐受度和影响抗性基因表达。大肠埃希氏菌BF形成过程主要需要特异性毒力黏附因子、胞外聚合物(EPS)以及群体感应(quorum sensing,QS)系统的参与，其中QS是生物膜发育成熟的关键，细胞通过产生小分子信息素(pheromone)-酰化高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)来完成细菌细胞间行为和功能的交流和协调。csgD(正调节卷曲菌毛产生)、bcsA操纵子(催化胞外纤维素形成)、fimB(调控Ⅰ型菌毛)、flu(促进黏附蛋白自动凝集)、rpoS(应激调节因子)以及QS相关基因luxS、mqsR、qseB、qseC、lsrK、lsrR等是参与BF结构建立的基因，它们表达量的变化直接或间接调控BF形成，是导致大肠埃希氏菌产生耐药性的重要原因[14]。

2 中药对大肠埃希氏菌耐药性的消减作用

中药具有多组分、抗菌活性广泛和低残毒特点，通常作用于多靶点来发挥抗菌或协同作用效果。目前，中药抑制大肠埃希氏菌耐药性机制研究主要集中在消除耐药质粒、改变细胞膜通透性、抑制酶(灭活酶或钝化酶)活性、多药外排泵和生物被膜形成等方面，国内外均有相关报道。

2.1 消除耐药质粒

耐药质粒的获得是导致细菌产生耐药性最广泛的机制，耐药菌株可以通过质粒(R-plasmid)并进行转移，以促进抗生素耐药性在细菌内和细菌间的转移，有研究证明，某些植物的提取物能够有效干扰耐药质粒稳定性和转移，如粗糠柴(Mallotusphilippensis(Lam.) Mull.Arg.)提取物在亚抑制浓度下能够显著降低携带四环素、卡那霉素等抗性基因的质粒在大肠埃希氏菌之间的共轭转移能力，且植物不同成分抑制活性以及同一成分对不同耐药菌株质粒的消除效果均存在差异，最高转移抑制率达99.7%[15]；生姜和辣椒中的主要刺激性成分姜醇(gingerol)和辣椒素(capsaicinoid)在浓度100 mg/L时能够降低多种大肠埃希氏菌耐药质粒活性，对携带一种和多种抗性基因的质粒均呈现出抑制效果，具有较广泛的抑制效应[16]；五倍子提取物与耐药大肠埃希氏菌作用48 h能够增强其对庆大霉素、卡那霉素等抗生素的敏感性，并消除一定程度的耐药质粒[17]。

2.2 对细胞膜通透性的影响

细胞质膜是细菌进行外部刺激，物质以及能量交换和代谢的场所，氨基糖苷类、大环内脂类、氟喹诺酮类等抗菌药物通过进入细胞膜与相应靶点作用杀灭细菌，当细胞膜通透性改变时，会使进入菌体内的含量下降，影响抗菌效果从而产生耐药性，有研究证明中药成分可以有效改善耐药菌通过细胞膜通透性的改变来耐受抗菌药物的现状，柳叶腊梅(Chimonanthussalicifolius)醇提取物与链霉素联用降低了大肠埃希氏菌磷消耗，破坏细胞质膜完整性使大分子物质和细胞质溢出，并通过干扰翻译过程抑制蛋白质合成，影响菌体正常生长过程以及细胞结构[18]；槲皮素(quercetin)能够恢复耐药大肠埃希氏菌对四环素类药物的敏感性(MIC从4 μg/mL～256 μg/mL减至1 μg/mL～64 μg/mL)，与四环素联合使用可以增加大肠埃希氏菌细胞膜通透性和药物进入菌体内的浓度，使细胞皱缩变形从而杀灭细菌[19]；小檗(Berberis)茎皮提取物和茶(Camelliasinensis)叶提取物也可以靶向破坏耐碳青霉烯类大肠埃希氏菌的细胞膜结构，并显著降低其对宿主细胞的毒害作用[20]。

2.3 抑制酶的活性

耐药细菌产生的灭活酶或者钝化酶通过水解作用使抗生素结构改变失去活性，目前研究较为深入的就是β-内酰胺酶，它的产生是大肠埃希氏菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因，包括丝氨酸依赖型酶和Zn2+依赖性酶2种类型，金属β-内酰胺酶(MBLs)是较为常见的一种β-内酰胺酶。有研究证明紫檀芪(pterostilbene)与多黏菌素B协同作用1 h可消除大肠埃希氏菌mcr-1和新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1)[21]；厚朴酚(magnolol)能够快速阻断底物与NDM-1的结合并导致酶失活[22]；黄芩苷同样对NDM-1酶具有良好的抑制作用，并有效的恢复氨苄西林和头孢呋辛钠的抗菌活性[23]；芦荟大黄素、槲皮素、香紫苏醇、木犀草素、苦参碱、大蒜素和五味子甲素均可以显著降低大肠埃希氏菌β-内酰胺酶活性，且抑制效果随浓度增加而增强，其中芦荟大黄素和苦参碱在浓度90 μg/mL时抑酶率达到81.7%和60.4%，有效减少菌体内β-内酰胺酶对抗生素的水解，起到逆转耐药性的作用[24]。

2.4 抑制耐药细菌外排泵

随着对耐药菌株外排系统研究的深入，研发应用高效外排泵抑制剂已成为减少细菌耐药性的重要途径。近年来国内外研究者已发现并证实多种中药提取物能抑制细菌外排泵并减少细菌耐药性，如白藜芦醇(resveratrol)具有减少AcrAB-TolC外排泵相关基因表达的能力，从而抑制大肠埃希氏菌的生长[25]；芍药苷通过降低大肠埃希氏菌转运蛋白AcrB的表达，减弱大肠埃希氏菌的外排泵活性并提高其对磷霉素钠的敏感性[26]；麦卢卡蜂蜜(Manuka honey)能够显著减弱大肠埃希氏菌细胞活力，并以剂量依赖的方式抑制细菌主动外排系统，增强外排泵作用底物在菌体内积聚[27]。

2.5 抑制生物被膜形成

生物被膜是细菌在营养限制、抗生素作用等多种压力下形成的有规律的生物群落系统，特殊的密集菌体生活可以促进抗性基因在细菌间的水平传播。Sun T等[28]用小檗碱(berberine)和苦参碱(matrine)处理耐药大肠埃希氏菌菌株发现，二者均能通过降低luxS、pfS、hflX、motA和fliA等基因的表达从而抑制生物被膜形成，使大肠埃希氏菌细胞变形，且小檗碱的抑制效果强于苦参碱。黄芩苷能够有效减少大肠埃希氏菌主要细菌黏附因子fimB的表达，并通过抑制毒力基因的表达来降低对细胞的黏附力从而降低生物被膜的形成[29]。穿心莲(Andrographispaniculate)乙酸乙酯提取物(≥250 μg/mL)能够显著减少大肠埃希氏菌胞外多糖的产生，从而抑制生物被膜的形成，其抑制效果与抗生素相当[30]。

除了上述5个方面的抗耐药机制涉及的中药外，还有许多植物及提取物也表现出抑制耐药大肠埃希氏菌生长的能力，如丁香酚(eugenol)能够延缓耐多药大肠埃希氏菌的生长期，破坏菌体细胞结构，在浓度为5 mg/mL时达到完全抑菌效果[31]，构树叶水提液能够一定程度上抑制耐药大肠埃希氏菌生长，与土霉素、头孢曲松钠等联合用药抑菌效果更明显[32]，但是目前这类中药的消减耐药性机制尚不明确，需深入研究。

3 结语

细菌耐药性现状严重且产生机制复杂多样，目前中药消减剂的筛选范围往往仅限于对细菌具有一定抑制作用的中药种类，所以多数中药消减剂为抑菌作用较强的清热类中药。但由于抑菌与耐药消减的机理存在差异，中药抑菌能力的强弱与其对细菌耐药性消减作用大小之间是否存在相关性尚无定论。目前，中药消减剂的选择存在针对性不强、效果不稳定等问题，要从根本上确定和增强中药对细菌的耐药消减效果，还需结合细菌耐药产生机制深入探明中药消减细菌耐药性的作用途径。