免疫层析技术研究及应用

刘 畅，杨琳燕，王艺霞，张 伟，李道稳，李留安，李 存

(天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392)

免疫层析技术(immunochromatographic analysis，ICA)始于20世纪后期，是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速检测技术[1]。由于检测周期短、成本低、对仪器设备和人员没有特殊要求，ICA在即时检测(point-of-care testing,POCT)方面发挥着不可替代的作用，发展前景广阔，其中最经典的一种标记检测技术是胶体金ICA[2]。随着纳米技术的发展和新材料的应用，ICA技术不断创新变革，将具有更广泛的应用范围和更广阔的开发前景。

1 ICA技术简介

1.1 ICA技术原理

以胶体金为例，ICA以胶体金标记抗原或抗体，层析过程中，胶体金标记物随样品溶液通过毛细作用在试纸条上移动，与测试线(test line,T线)上相应的受体结合，聚集后显红棕色[3]。T线的颜色深浅反映了样品中待测物的含量。同时设质控线(control line,C线)，验证检测结果是否有效。

根据待测分子的大小和结合方式，ICA可分为夹心法和竞争法[2]。夹心法是指待测抗原的不同表位分别与两种抗体结合，在试纸条上形成抗体1-抗原-抗体2夹心结构[4]，适用于大分子待测物。竞争法一般用于小分子，T线用待测抗原或抗原类似物处理，它与待测物竞争结合标记抗体，所以T线颜色强度与待测物的含量成反比[5]。

1.2 ICA的发展趋势

1.2.1 灵敏度提高 高灵敏度、定量检测和多元检测是ICA技术的发展趋势[6]。免疫标记材料是影响灵敏度的一个重要因素。胶体金是应用最早、应用最广泛的标记材料，但灵敏度偏低[7]。量子点(quantum dot,QD)[8]、时间分辨荧光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)[9]以及磁性微球(magnetic bead,MB)[10]等新型标记材料的出现使得ICA的灵敏度不断提高。Lu T等[11]以胶体金和QD作为信号标签，分别建立了两种检测Ⅱ型志贺毒素的ICA方法，胶体金ICA的检测限为25 ng/mL，QD ICA方法为5 ng/mL，灵敏度明显高于胶体金方法。

生物素-亲和素系统(biotin avidin system，BAS)[12]、贵金属[13]、脂质体[4]等信号放大系统的应用也对ICA技术灵敏度的提高起到了积极作用。BAS亲和力极强，有信号放大作用，可与蛋白等生物分子结合而不破坏其活性。Serebrennikova K V等[12]依靠BAS提高了胶体金ICA的灵敏度，其灵敏度比常规胶体金方法提高了4倍。Anfossi L等[8]制备了CdSe QD，以金、银纳米粒子作为淬灭剂，建立了检测玉米粉中伏马菌素的ICA方法。通过淬灭剂的作用，荧光信号随伏马菌素的含量成倍变化，检测限范围在1.56 ng/mL～6.25 ng/mL之间，比普通方法低4倍。

1.2.2 半定量、定量检测 ICA的半定量、定量方法也在逐步发展。Serebrennikova K V等[14]同时用3个不同浓度的金标抗体包被试纸条T区，制成多范围梯度的ICA，可快速实现降钙素原的半定量测定。Zhang X等[15]分别将赭曲毒素A(ochratoxin，OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)的结合抗原喷涂在NC膜上，建立胶体金ICA方法，借助便携式读卡器能够同时对玉米、小麦和饲料中的OTA、ZEN进行定量。Han M M等[16]构建了可同时检测牛奶中的黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)、三聚氰胺以及6种抗生素的胶体金检测卡，拍照后用Image J软件分析能够得到半定量结果。Li X M等[17]开发了一个Android应用程序，可以快速定量玉米和饲料中ZEN的ICA分析结果，并且支持检测结果共享。荧光定量阅读器[18]、磁信号阅读[19]等仪器可用于量化检测结果，自动化程度高，结果客观、准确。

1.2.3 层析材料的变化 常用的ICA常用聚酯纤维、玻璃纤维、尼龙膜等作为固定材料，现在的固定材料以硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)居多。NC膜对生物大分子的吸附性强[4]，性质稳定，便于保存；亲水性好，样品溶液可以在膜上快速层析，从而实现快速检测。有些公司已经开发一体化材料，同时作为样品垫、结合垫、固定膜和吸水垫，推动免疫层析技术朝着更加简便的方向发展。

2 ICA标记材料的分类

2.1 胶体金

胶体金是用氯金酸溶液制成的稳定的胶体溶液。胶体金技术的原理是用胶体金为标记材料，随着抗原抗体反应的进行，胶体金在NC膜的T线集聚并显出红棕色[3]。具有操作简便、迅速，不依赖任何仪器的特点。然而，由于灵敏度不够理想，胶体金法一般用于对目标物的初筛检测。Serebrennikova K V等[14]在传统胶体金方法的基础上进行改进，制得直径为100 nm的纳米金花并将其用于ICA，方法的灵敏度提高了5倍。Zeng Y Y等[20]用生物素和链霉亲和素对金纳米颗粒进行双标记，构建了一种带有荧光背景阻断的新型胶体金ICA方法。该方法对于猪尿液中克仑特罗的检测限为0.03 μg/L，灵敏度比传统的胶体金方法提高了60倍。

2.2 荧光标记材料

荧光ICA是以荧光材料标记抗原或抗体，待测物与之结合后形成带有荧光标记的免疫复合物，通过测定免疫复合物的荧光含量即可推算待测物的浓度。荧光ICA方法的背景干扰小，灵敏度高；缺点是检测结果肉眼不可见，需要与相关仪器联用，而且荧光存在自然淬灭现象，保存成本较高[11]。

2.2.1 量子点 量子点(QD)主要由ⅡB族～ⅥA族或ⅢA族～ⅤA族元素构成，是能够产生荧光的半导体纳米颗粒[21]。QD具有优良的标记特性和光化学稳定性，激发光谱宽、发射光谱窄，荧光强度高[22]，是一种很好的标记材料。Huang Z等[23]针对猪尿液中的克仑特罗，在磁珠表面组装QD，在此基础上建立了一种灵敏度高、耐基质干扰的克仑特罗ICA检测方法。QD可单独作为一种标记材料，与MNP材料同时使用能够简化制备过程，同时结果判定方式变得多样化。Xie S L等[18]使用不同的CdSe/ZnS QD建立了一种能够同时检测鸡肉中金刚烷胺和氯霉素的定量ICA方法。分析结果与市售ELISA试剂盒检测结果相符，对于金刚烷胺和氯霉素的检测限分别为0.18 ng/g和0.016 ng/g。

2.2.2 时间分辨荧光微球 时间分辨荧光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)由稀土元素构成，表面有丰富的官能团可用来偶联抗体，Stokes位移大，荧光效率高[24]。Stokes位移是指荧光光谱较相应的吸收光谱红移，是最大荧光发射波长与最大吸收波长之间的差值。较大的Stokes位移能够增强荧光材料的抗干扰能力，提高信噪比，有助于提高检测的灵敏度[25]。Li X M等[9]利用胶体金、乳胶微球和TrFM作为抗体标记示踪剂，分别建立了3种检测牛奶和猪肉中泰乐菌素和替米考星残留的ICA方法。其中以TrFM为标记物的方法灵敏度高、制备成本较低、抗体消耗量少，有希望用于现场检测和大批量样本筛选。

2.2.3 上转换纳米颗粒 上转换纳米颗粒(upconversional nanoparticles,UCNP)由稀土金属元素掺杂惰性氧化物构成，在近红外光激发下表现出强荧光[26]，抗光漂白能力强，背景干扰小，发光寿命长[27]，具有天然材料所不具备的优点。但UCNP的量子产率很低，在实际应用中受限制[28]。李丹阳等[27]使用磷酸化的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)适配体包裹UCNPs，结合ICA方法快速定性并定量花生中的AFB1，检测限为2.4 ng/mL，结果准确，具有潜在的实用价值。

2.3 磁性纳米颗粒

以Fe3O4为代表的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNP)是近些年发展起来的一种新型标记物。普通ICA通过T线的颜色强度反映待测物含量，但肉眼或读卡器只能观察记录NC膜表面约10 μm厚度的颜色信号。如果以MNP为ICA的标记材料，磁信号阅读器能够对整个NC膜上(约150 μm厚)MNPs的磁场进行定量[5]；而且，一般生物样品中不含磁信号，背景信号低，因此灵敏度更高。MNP也促进了ICA由定性向定量发展，使检测过程更加快速、准确、高效。Mu X H等[19]以MNP为标记材料，用磁敏传感器检测试纸条上相应位置的磁场强度，建立了一种检测蓖麻毒素的ICA方法，该方法克服了样品背景色的干扰，检测限为1 ng/mL，能够满足水、土壤和食物等模拟样品的检测要求。Wang C等[29]建立了可准确测定血清中非结合雌三醇的MNP ICA方法，磁信号稳定，结果与TrFM ICA方法有较好的相关性。

3 免疫层析技术的应用

3.1 兽药残留检测

兽药残留问题与人体健康和环境安全息息相关，虽然我国对兽药的休药期和残留限量作了规定，但兽药的不规范使用、非法滥用现象依然存在。ICA技术对仪器的依赖性小，数分钟内即可观察检测结果，适合即时检验(point-of-care testing，POCT)和大批量样本初筛。顾娟红等[30]制备了金磁复合微粒，并以此为标记物实现对盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的定性、定量检测。对于二者的检测限分别为0.25 ng/mL和0.5 ng/mL，特异性良好。金磁复合微粒兼有MNPs的磁性和纳米金的光学性质，检测结果既可以眼观，也可通过磁定量分析仪快速定量，灵敏度比传统的胶体金方法有所提高。郭会灿[31]采用QD ICA技术快速检测4种硝基呋喃类代谢物，对3-氨基-2-恶唑烷酮、1-氨基-2-乙内酰、氨基脲和5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的检测限分别为0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L，交叉反应率在0.1%以下，能够满足常规检测的要求。兽药残留一般采用竞争性ICA检测，T线变浅或消失意味着样品呈阳性。相比于消色，显色无疑是一种更灵敏的方式，Sheng W等[32]以ZnCdSe/ZnS QDs作为荧光标记，金纳米粒子作为淬灭剂，建立了一种检测四环素类抗生素的ICA方法，在紫外灯照射下，T线的荧光强度与待测物含量成正比，该方法对于牛奶和动物肌肉组织中四环素类抗生素的检测限分别是20 μg/L和40 μg/kg。

3.2 食品安全检测

玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒毒B1(AFB1)等霉菌毒素一般存在于霉变的农作物中，动物源性食品中也常有检出，采用ICA技术可以灵敏、快速的检出食品中的霉菌毒素和其他有害物质。何方洋等[33]建立了检测谷物中ZEN的胶体金ICA法，方法的检测限为100 μg/kg，灵敏度为99%，特异性为94%。Yao X L等[34]以MNP作为信号标签建立了一种用于检测食品中17 β-雌二醇(17 β-estradiol,E2)的新型ICA方法，对于牛奶、对虾、鱼类和鸡肉中17 β-雌二醇的最低检测限是0.4 ng/mL。沙志聪等[7]采用QD标记的ICA检测谷物中的赭曲霉毒素A，该方法的特异性良好，结果准确，检测限为0.5 μg/L。激素类药物有利于动物的生长和繁育，但食品中激素残留超标可能导致人体的激素代谢紊乱或引起其他疾病。Yao X L等[34]以游离的抗17 β-雌二醇单克隆抗体作为检测抗体，MNP标记的山羊抗小鼠IgG作为间接信号探针，建立了一种用于检测食品中E2的新型ICA方法，对牛奶、对虾、鱼类和鸡肉中E2的最低检测限是0.4 ng/mL，灵敏度是常规竞争性ICA方法的5倍。

3.3 动物疾病诊断

病原微生物入侵动物机体后能够刺激机体产生抗体，利用该原理可以对抗原进行检测，诊断动物疾病。肖妍等[35]建立了一种检测奶样中布鲁氏菌抗体的免疫层析方法，敏感性98.0%，特异性96.0%，与其他常见病原无交叉反应，适用于大批量样本的筛选检测和奶牛场布鲁氏菌病的快速诊断。Bian H等[36]建立了一种用于检测猪流行性腹泻病毒的胶体金ICA方法，检测限为0.47 μg/mL(5.9×103TCID50/mL)，与其他猪病病毒无交叉反应。

4 小结

ICA检测过程简便、快速，在兽药残留、食品安全、环境监测以及动物疾病诊断等领域表现出独特优势。高灵敏度、定量和高通量检测是ICA方法的发展趋势。荧光材料、MNPs和脂质体等开始代替胶体金，新型材料的使用对于灵敏度的提高有积极作用。ICA结果的评价方式也随着检测需求而变化，既可以通过肉眼观察直接定性，也可以使用荧光定量仪、磁阅读器或相关软件准确定量。随着新型标记材料的发展和定量分析仪器的应用，ICA技术也会得到巨大的提升，在POCT方面发挥更重要的作用。