新疆北部地区蜱传嗜吞噬细胞无浆体病原学检测与分子遗传进化分析

吴泽功，林汉亮,罗 金，马力克·艾则孜，任巧云，罗 毅，马 站，殷 宏，4 ，李 奎，刘光远，4*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002;2.中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜动物疫病国家重点实验室，甘肃兰州 730046 3.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830011;4.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

蜱是一类吸血性外寄生虫，宿主繁多且地理分布广泛，现有报道显示，除部分水生动物不是其宿主外，蜱可以侵袭任何动物[1]。蜱不仅自身对动物造成机械损伤，而且可以传播诸多疾病，例如病毒病、细菌病、寄生虫病等，给人类正常的生产生活、动物健康以及公共卫生事业带来极大的危害[2]。

无浆体是一类通过蜱传播的革兰氏阴性胞内细菌性病原，其通过蜱叮咬宿主专一性地寄生于宿主红细胞中。该病原可造成宿主动物的发热、贫血、消瘦等为特征的临床症状[3-4]。据杨吉飞等报道，目前引起该病的无浆体病原可分为7个种，其中嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasmaphagocytophilum)是一种重要的人畜共患病原，而边缘无浆体(A.marginale)、牛无浆体(A.bovis)和中央无浆体(A.centrale)主要感染牛，山羊无浆体(A.capra)主要感染山羊，羊无浆体(A.ovis)主要感染羊、鹿等，扁平无浆体(Anaplasmaplatys)主要感染小型啮齿动物，如犬、鼠等[5-7]。嗜吞噬细胞无浆体自2006年在安徽省人体内发现以来，迄今在我国多个省份和地区均有报道，且通过分子流行病学和血清学调查发现，A.phagocytophilum在我国非疫区的人血液中也普遍流行[8-9]。

本研究就新疆北部地区13个县(市)蜱及牛、羊体内蜱传播性A.phagocytophilum病原的流行情况进行调查，试图弄清该病原的主要传播媒介及分子遗传特征，为进一步制定该病原的防控措施提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 自2018年4月至2019年6月分别收集新疆阿勒泰地区、塔城地区、博尔塔拉蒙古自治州和伊犁自治州共13个县(市)1 301份牛、羊血液样本(牛血共670份，羊血液共631份)及相应活动范围内的609只蜱虫，牛血液样品平均每个县(市)约52头份，羊血液样品平均每个县(市)约49头份，蜱虫样品平均每个县(市)约47只。蜱虫依据其形态学特征在家畜疫病病原生物学国家重点实验室进行分类鉴定[10]。

1.1.2 主要试剂 血液基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；动物组织基因组提取试剂盒，凯杰生物技术(上海)有限公司产品；琼脂糖，英潍捷基(上海)贸易有限公司产品；pGEM-T Easy连接载体，上海普洛麦格生物产品有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、JM-109 感受态细胞、PremixTaq(ExTaqVersion2.0 plus dye)保真性聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，OMEGA广州飞扬生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(BSC-04IIA2)，苏州安泰空气技术有限公司产品；PCR仪(SimpliAmp PCR)，Thermo Scientific公司产品；核酸电泳分析仪(DYY-12型)，北京六一生物科技有限公司产品；全自动凝胶成像仪(SKL-4-01-018)，上海培清科技有限公司产品；小型4℃离心机(5810R)，Eddendorf 公司产品；恒温水浴锅(DK-500S)，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品基因组的提取 利用血液基因组提取试剂盒和动物组织基因组提取试剂盒，分别对待检血液样品和蜱虫样本逐一提取基因组DNA，获得的基因组DNA进行电泳分析，以保证其完整性，并于-20℃条件保存备用。

1.2.2 样本的PCR检测 本研究中对所有样本进行检测均采用套式PCR，对A.phagocytophilum16S rRNA基因PCR扩增体系为25 μL，PremixTaq酶12 μL，上、下游引物各1 μL，基因组DNA 2 μL，灭菌的无核酸水9 μL，引物信息见表1。反应条件：第一轮反应中，94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共34个循环；72 ℃ 5 min ；以第一轮PCR扩增产物1 μL稀释100倍，吸取其中2 μL作为模板进行第二轮PCR扩增，95 ℃预变性3 min；55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min 。A.phagocytophilumMSP4基因PCR扩增体系和条件16S rRNA基因PCR扩增体系和条件。

表1 本研究引物序列

1.2.3 PCR产物克隆及序列分析 上述的PCR产物经电泳检测后，随即挑取1/3的阳性样品进行胶回收纯化，后续鉴定纯化产物无误后连接到pGEM-T Easy载体上，37 ℃连接90 min后，将连接产物转化入JM-109感受态细胞，涂布氨苄抗性琼脂平板后放置在37 ℃恒温箱，倒置过夜培养；次日挑单克隆菌落扩大培养，经菌液PCR鉴定无误的阳性菌液进行质粒的抽提，提取的质粒送华大基因(六合)北京有限公司进行测序鉴定。测序结果使用NCBI在线软件Blastn和Lasergene DNAstar 7.1分子生物学软件进行同源性比对分析。

1.2.4 基于16S rRNA基因和MSP4基因的A.phagocytophilum系统发育树构建 从NCBI数据库中下载已公布的A.phagocytophilum的16S rRNA和MSP4基因序列，将立克次体16S rRNA基因序列(RickettsiaconoriiNR074480.2)和埃里克体MSP4基因序列(EhrlichiachaffeensisAF479837.1)作为外群，以本试验扩增得到的嗜吞噬细胞无浆体的16S rRNA和MSP4基因序列为靶标序列，通过MEGA-Align 7.0软件使用邻接法(NJ法)构建分子系统发育树，其中Bootstrap值检验次数设置为1 000。

2 结果

2.1 蜱的分类及A.phagocytophilum不同基因位点的扩增结果

本研究所采集的蜱主要包括草原革蜱(Dermacentornuttalli)、亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)、小亚璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)、麻点璃眼蜱(Hyalommarufipes)和血红扇头蜱(Rhipicephalussanguineus)。对蜱及家畜血样的PCR检测结果显示，A.phagocytophilum16S rRNA基因特异性扩增片段为546 bp，MSP4为381 bp，均与预期结果一致。

2.2 新疆北部不同地区牛、羊血液中A.phagocytophilum感染情况

检测结果显示，新疆北部地区收集的1 910份蜱和牛羊血液样品总体感染率为9.3%(177/1 910)。该病原在609份蜱虫样本中的感染率为8.2% (n=50)。 670份牛血液和631份羊血液中的感染率分别为10.0% (n=67)和9.5% (n=60)。其中伊犁地区牛、羊A.phagocytophilum感染率最高，达15.3% (46/300),其次是伊犁哈萨克自治州的10.5% (42/400)，而哈密地区和博尔塔拉蒙古自治州感染率较低,分别为4.0%(8/199)和7.1%(14/196)。新疆北部不同地区牛、羊血液中A.phagocytophilum感染情况情况如表2所示。

2.3 新疆北部地区不同县(市)蜱虫及牛、羊血液中A.phagocytophilum感染情况

由检测结果可知，新疆北部地区伊犁自治州伊宁市和新源县牛、羊和蜱虫感染率明显高于其他地区的县(市)，伊宁市和新源县A.phagocytophilum总体感染率分别为17.7%(25/141)和15.8%(243/152)。而哈密地区哈密市、巴里坤县以及阿勒泰地区哈巴河县牛、羊血液和蜱虫感染率较低，其总体感染率分别为3.6%(5/141)、2.8%(4/141)和4.1%(6/145)。同时，在A.phagocytophilum感染率较高的县(市)，蜱虫感染A.phagocytophilum感染率也较高，且显著高于其他县(市)蜱虫A.phagocytophilum的感染率。前述中伊宁市和新源县总体感染率高于其他县(市)，其蜱虫感染A.phagocytophilum的感染率分别为17.8 (8/45)和12.5 %(6/48)，也明显高于其他县(市)的蜱虫感染率。此外，阿勒泰地区阿勒泰市、布尔津县以及塔城地区塔城市A.phagocytophilum总体感染率也较高，感染率分别为15.7%(24/153)、13.3%(20/150)和12.3%(18/146)，而这些地区(县市)蜱虫感染A.phagocytophilum的感染率也高于其他地区的县(市)，这些地区(县市)蜱虫感染A.phagocytophilum感染率分别为17.0%(9/53)、10.4%(5/48)和15.2%(7/46)。新疆北部地区不同县(市)蜱虫及牛、羊血液中A.phagocytophilum感染情况如表3所示。

表2 不同地区蜱虫和血液样品中A.phagocytophilum感染情况统计表

2.4 新疆北部地区不同种类蜱虫中A.phagocytophilum感染情况

对新疆北部地区收集的蜱虫样品进行PCR检测结果显示，在血红扇头蜱、小亚璃眼蜱和草原革蜱中感染率较高，感染率分别为11.7% (16/137)、10.2%(12/118)和8.8% (10/113)。其中麻点璃眼蜱的感染率最低，感染率为4.5%(5/112)。新疆北部地区不同种类蜱虫的A.phagocytophilum感染情况如表4所示。

2.5 A.phagocytophilum 16S rRNA核酸系统发育分析

PCR检测阳性样本中测序获得的A.phagocytophilum16S rRNA基因序列，通过Lasergene DNA Star 7.1和NCBI在线Blast序列比对软件进行多序列比对后，基于邻近法构建16S rRNA基因的系统发育树。结果显示，塔城市、尼勒克县的亚洲璃眼蜱和伊宁市牛血液中检测到的A.phagocytophilum16S rRNA核酸序列与新疆喀什市、皮山县和叶城县绵羊血液中检测到的基因序列同源性为99.8%～100%，额敏县牛血液和布尔津县麻点璃眼蜱中检测到的病原基因序列与湖北地区山羊体内检测到的病原序列同源性为99.5%～99.7%，进化树分析显示与新疆南部地区以及湖北地区检测到的A.phagocytophilum16S rRNA核酸序列分在两个进化分支。而在阿勒泰市草原革蜱、血红扇头蜱和吉木乃县小亚璃眼蜱体内，以及巴里坤县和新源县绵羊血液中检测到的A.phagocytophilum16S rRNA核酸序列与俄罗斯乌拉尔地区、额木斯克地区和图瓦共和国全沟硬蜱体内检测的病原16S rRNA核酸序列同源性较高(88.0%～99.2%)，同时与土耳其、德国等中亚、中欧国家序列同源性也较高(92.7%～99.5%)。进化树分析显示，阿勒泰市、吉木乃县、巴里坤县和新源县的A.phagocytophilum16S rRNA核酸序列与中亚、中欧国家蜱虫及野生动物体内检测到的病原16S rRNA基因序列在一个进化分支(图1)。

表3 不同市(县)蜱虫和血液样品中A.phagocytophilum感染情况统计表

表4 不同种类蜱虫样品中A.phagocytophilum感染情况统计表

2.6 A.phagocytophilum MSP4基因系统发育分析

为了进一步的验证从牛、羊和蜱虫体内检测到的A.phagocytophilum的遗传进化关系，基于A.phagocytophilumMSP4基因构建了系统发育树。结果显示，阿勒泰市草原革蜱、血红扇头蜱和吉木乃县小亚璃眼蜱体内以及巴里坤县和新源县绵羊血液中检测到的A.phagocytophilumMSP4基因序列与中国东北地区(中俄边境地区)绵羊和俄罗斯西伯利亚地区全沟硬蜱体内检测的病原MSP4基因序列同源性较高(95.2%～96.7%)，同时与斯洛伐克、法国、西班牙等中亚、中欧国家野鹿、野猪、马血液中以及蓖子硬蜱、草原革蜱体内检测到的A.phagocytophilumMSP4基因序列同源性也较高(95.7%～96.7%)，基于A.phagocytophilumMSP4基因构建的进化树分析显示，与中亚、中欧多个国家和我国东北地区家畜、蜱及野生动物检测到的A.phagocytophilumMSP4基因序列在一个进化分支。而在塔城市的亚洲璃眼蜱和布尔津县麻点璃眼蜱体内检测到的A.phagocytophilumMSP4基因序列与国内河南地区山羊血液中检测到的病原序列同源性较高，为90.4%～96.6%，进化树分析显示与国内河南地区检测到的A.phagocytophilumMSP4基因序列在一个进化分支(图2)。

图1 基于16 S rRNA基因的A.phagocytophilum遗传进化树分析

图2 基于MSP4基因的A.phagocytophilum遗传进化树分析

3 讨论

据相关文献报道，最早于2003年在我国黑龙江的全沟硬蜱中检测到A.phagocytophilum基因序列的存在，阳性率为6.2%(40/643)[11]。2006年在我国安徽芜湖暴发了人群体感染A.phagocytophilum病原的不明原因发热疫情，最终被确诊为人类粒细胞无形体病，后续作为一种新发传染病被卫生部门列入防控事项[7-8]。杨吉飞、王阶等在新疆南疆部分地区和乌鲁木齐的牛、羊和犬血液中检测到了A.phagocytophilum基因序列和血清阳性抗体，阳性率分别为17.6% (44/250)和1.5% (1/68)[12-13]。本次检测结果显示，在新疆北部地区13县(市)的蜱虫和牛、羊A.phagocytophilum总感染率为9.3%(177/1 910)。不同宿主的检测结果显示，牛、羊和蜱虫感染率分别为10.0%(67/670)、9.5% (60/631)和8.2%(50/609)。不同地区及不同县(市)检测结果显示，新疆北部地区不同地区及不同县(市)A.phagocytophilum感染情况存在差异，伊犁自治州牛、羊和蜱虫感染A.phagocytophilum总感染率明显高于阿勒泰地区、塔城地区、哈密地区和博尔塔拉蒙古自治州，5个地区(州)的A.phagocytophilum总体感染率分别为14.7%、10.3%、8.3%、5.9%和3.2%。伊犁哈萨克自治州伊宁市和新源县牛、羊和蜱虫感染A.phagocytophilum感染率高于尼勒克县，3个县(市)总的感染率分别为17.7%、15.8%和10.7%。阿勒泰地区阿勒泰市和布尔津县牛、羊及蜱虫感染A.phagocytophilum的感染率也明显高于其他2个县(市)，4个县(市)总的感染率分别为15.7%、13.3%、7.5%和3.0%。不同种类的蜱虫和家畜检测结果显示，新疆北部地区不同种类的蜱虫和家畜感染的A.phagocytophilum也存在差异。血红扇头蜱感染A.phagocytophilum的感染率最高，感染率为11.7% (16/137)，其次为小亚璃眼蜱10.2 %(12/118)、草原革蜱8.8 %(10/113)和亚洲璃眼蜱5.4 %(7/129)，感染率最低的为麻点璃眼蜱5.2 %(5/112)。牛血液样品感染A.phagocytophilum的阳性率为10.0%(67/670)，感染率略高于羊血液样品的9.5%(60/631)。此外，A.phagocytophilum16S rRNA和MSP4遗传进化分析显示，新疆北部地区的A.phagocytophilum16S rRNA基因可以分为3个进化分支，其中塔城市、尼勒克县、布尔津县的亚洲璃眼蜱、麻点璃眼蜱及伊宁市、额敏县牛体内获得的病原16S rRNA基因与新疆南疆地区和我国湖北地区获得基因序列分在2个遗传进化分支，序列同源性分别为99.8%和 99.5%～99.7%。阿勒泰市和吉木乃县的草原革蜱、血红扇头蜱和小亚璃眼蜱以及巴里坤县和新源县绵羊体内获得的A.phagocytophilum16S rRNA基因序列与中亚、中欧多个国家蜱及野生动物体内检测到的病原基因序列在一个进化分支，序列同源性为92.7%～99.5%。后续为了进一步的验证此次获得A.phagocytophilum基因遗传进化关系，基于A.phagocytophilumMSP4基因进行遗传进化分析，结果显示阿勒泰市、吉木乃县、巴里坤县和新源县蜱虫及绵羊体内获得的A.phagocytophilumMSP4基因序列与中亚、中欧多个国家以及中俄边境地区家畜、野生动物和蜱体内获得的A.phagocytophilumMSP4基因序列在一个进化分支，序列同源性为同源性为95.7%～96.7%。在此次调查中，一共捕获到了草原革蜱、亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱、麻点璃眼蜱和血红扇头蜱5种新疆常见蜱种，共计609只，平均每个县(市)蜱虫样本约47份，对应蜱虫的采样县(市)收集了670份牛血液样本和631份羊血液样本，平均每个县(市)血液样本大于47份。通过PCR检测证实了A.phagocytophilum病原在新疆北部地区A.phagocytophilum的感染率较高(9.3%)，蜱虫感染A.phagocytophilum较为严重的地区和县(市)，该地区及县(市)牛羊感染该病原的感染率也较高，且蜱虫感染A.phagocytophilum的感染率与其宿主牛、羊感染A.phagocytophilum的的感染率较为接近(10.0%、9.5%和8.2%)。这与当地的畜牧模式以及A.phagocytophilum传播媒介的分布具有一定的关联。此外，通过A.phagocytophilum16S rRNA基因和MSP4基因序遗传进化分析显示，新疆北部地区部分蜱虫和家畜体内检测到的A.phagocytophilum基因序列与中亚、中欧多个国家家畜、野生动物和蜱体内检测到的病原基因在一个遗传进化分支，序列同源性高达96.7%～99.5%，也说明了这种经蜱虫传播的病原在新疆北部地区可能存在着跨境传播的风险。我国新疆北部地区与中亚多个国家接壤地带较多，长期以来与我国保持着密切的牲畜及畜产品贸易往来[14]。接壤地带上不同的地形特征和气候条件不仅为动物迁徙和定居创造了优良条件，也为蜱虫以及蜱虫为媒介的病原分布和传播创造了可能[15]。新疆阿勒泰地区和伊犁哈萨克自治州是新疆畜牧业生产重要的地区，拥有广阔的天然草场，优良草地占比高，载畜量大，且畜种资源丰富(阿勒泰羊、新疆褐牛、伊犁马、哈萨克羊等)[16]。这些得天独厚的条件不仅有利于以绵羊、山羊、牛、马和骆驼等家畜的放牧和饲养，也为蜱虫的生长以及蜱传播性疫病传播提供了良好“生境”和寄主环境[17]。据现有文献记载新疆已发现2科9属42种蜱，占全国已知蜱虫种类的1/3，且目前在新疆北部不同地区和县(市)蜱虫中检测到的蜱传播性病原多达数10 种[18]。新疆阿勒泰地区和伊犁自治州天然的草场资源适合于牛、羊的放牧饲养，适宜牛、羊放牧的环境也适于各种硬蜱的生存和繁育[15]。在自然环境中，蜱虫可以通过叮咬牲畜和人来传播A.phagocytophilum[6,16]。这也提示着我们这种经蜱传播的人畜共患病原可能会随着宿主的更换在新疆地区传播和流行，增加了当地居民和游客感染A.phagocytophilum病原的风险。因此，加强硬蜱的防控，同时应推广新型杀蜱药物和普及蜱虫防治知识，对于防治蜱虫及蜱传播性疫病过程中具有重要意义。