HSP在热应激条件下调控鸡心肌细胞损伤的功能分析

连锐锐，李桂明，孙传熙，李 真，刘月月，杨世发，林树乾，石有斐，殷 斌*，万仁忠*

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.山东省农业科学院家禽研究所，山东济南 250023)

热应激(heat stress)是指机体遭受环境温度超过等热区上限的高温度刺激时，导致机体产生的一系列非特异性反应，也称为热应激反应。短暂的过高温刺激或长时间持续热应激，会导致动物机体出现器官衰竭，严重时甚至会促发死亡。在我国，大部分地区每年夏天都会出现超过动物等热区上限的持续高温天气(35 ℃～40 ℃)，不仅会影响畜禽产品品质，还会影响动物的生产、繁殖、健康、福利，对包括人类在内的动物生命构成了严重的威胁[1-2]。家禽缺少汗腺，对热敏感，热应激成为影响家禽生产性能的关键问题之一[3]。

热应激会导致蛋白质变性、聚集，使可溶性蛋白转变为不可溶性蛋白蓄积在细胞内，造成蛋白稳态的失衡，对机体造成损伤。热休克反应(heat shock response，HSR)是机体在遭受应激刺激时，以上调热休克蛋白(heat shock protein，HSP)为特征的防御性适应反应，可以有效缓解蛋白稳态的失衡[4]。HSP作为分子伴侣，可以帮助蛋白质的正确折叠、移位、复性和降解，还可以维持细胞骨架结构发挥重要的内源性保护作用，可被缺氧、缺血、热应激、氧化应激等各种短暂的应激所激活[5-7]。Hsps是否能被正常激活，决定对应激的耐受性是否形成，其表达量与细胞对应激的耐受性呈正相关。采用药物刺激(如阿司匹林、辅酶Q10)诱导Hsp70高表达，会增加细胞在同等热应激条件下的存活率[8-9]，而采用Hsp70的抑制剂(槲皮素)会导致细胞在热应激条件下的存活率会显著下降[10]。过表达CRYAB可以通过稳定细胞骨架结构和调控细胞周期，显著提高心肌细胞H9C2的耐热性，且其保护效果与CRYAB过表达量成正相关[11]。HSP参与细胞抗凋亡的各个途径，其提高细胞的耐受性与HSP抗细胞凋亡的作用密切相关，但热应激条件下，HSP如何调控细胞凋亡的作用机制目前尚不清晰。

本研究基于系统生物学分析方法，获取家禽与热应激相关的基因，通过GO富集分析方法，筛选出调控细胞凋亡相关的基因，并利用STRING数据库分析其相互间作用关系。为进一步确定热应激激活HSP的高表达，发挥内源性保护作用，以300日龄蛋鸡构建热应激试验动物模型，探讨不同的热应激时间点对家禽的损伤以及对HSP的诱导规律，为揭示HSP在热应激损伤中发挥的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 300日龄健康海兰褐蛋鸡40只，购自济南鸣仁畜牧养殖有限公司。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、反转录试剂盒、TB Green Premix ExTaqⅡ(2x)，日本TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器 光学显微镜，重庆重光实业有限公司产品；低温冷冻离心机(Sorval Legend Micro 17 R)，美国Thermo Fisher公司产品；PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；荧光定量PCR仪(QuantStudio7 Flex)，美国Applied Biosystems公司产品。

1.2 方法

1.2.1 受试鸡热应激模型的构建及样品采集 40只300日龄海兰褐蛋鸡随机分为4组，分别为热应激0、1、3、5 d组，每组10只。按组分群后在控温控湿的环境(温度25 ℃±1 ℃，相对湿度约60%)中进行为期7 d的适应性饲养，试验期间自由饮食、饮水。待适应期结束后，进入热应激处理期，热应激温度为38 ℃2 ℃，湿度保持在60%，热应激期间自由饮食、饮水，分别进行0、1、3、5 d的热应激处理。热应激期间实时观察受试鸡的行为状态，热应激结束采集血液和心脏组织。采集的血液立刻分离血清后，用于鸡心肌细胞损伤相关酶的检测；心脏组织分别置于40 mg/mL甲醛和液氮中，以备组织病理学和分子生物学检测。

1.2.2 心肌损伤酶谱的检测 鸡血清中肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)的检测,送至济南金域检测中心检测采用自动生化分析仪进行。

1.2.3 受试鸡心肌组织应激性病理损伤检测 取出固定于40 mg/mL甲醛中的心脏组织，经过梯度浓度乙醇脱水后进行二甲苯透明处理，然后完成组织的石蜡包埋、切片和HE染色程序，并在400倍显微镜下观察心肌组织病理学变化。

1.2.4 受试鸡心肌组织Hsp转录水平的动态检测 从冻存管内取出心肌组织，用灭菌剪刀在心尖位置剪取约0.2 g的组织于1.5 mL灭菌离心管内，加入200 μL RNAiso Plus，用研磨棒进行研磨，研磨充分后再加入800 μL RNAiso Plus充分裂解组织，冰上裂解10 min后，加入200 μL氯仿，混匀约30 s，冰盒上放置5 min后，12 000 r/min 4 ℃下离心15 min。取上清液约500 μL转移至新的离心管，按等体积的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20 ℃环境中静置沉淀1 h。冰箱内取出后12 000 r/min 4 ℃下离心15 min，弃掉上清液。各管加入预冷的750 mL/L乙醇1 mL，上下颠倒洗涤，7 500 r/min、 4 ℃离心5 min，弃掉上清，再以7 500 r/min 、4 ℃离心2 min，用移液枪小心吸干残留乙醇，室温下干燥3 min。加入无RNA酶灭菌水20 μL，吹打溶解RNA，溶解后的RNA进行浓度与纯度检测。

反转录采用10 μL体系，按照说明书进行，反转录得到的cDNA置于-80 ℃保存，备用。Real-time PCR所需要的引物根据NCBI中已发表的鸡Cryab、Hsp27、Hsp70、以及Gapdh的基因序列为参照模板，用Primer 5.0 软件设计，由济南博尚公司合成，引物序列见表1。cDNA模板经过5倍稀释后使用，real-time PCR反应采用20 μL体系：2×TB Green Premix ExTaq10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free水6.4 μL。扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每个样品基因的相对表达水平根据甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)Ct值标准化，并使用2-ΔΔCt方法定量。

1.2.5 基于网络药理学探究Hsps调控细胞凋亡的作用机制

1.2.5.1 家禽热应激作用靶标间相互作用网络的构建 通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库Gene检索板块，查找与家禽热应激相关的疾病靶标。利用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)，获得家禽热应激相关靶标间的相互作用关系，筛选评分≥0.7的相互作用关系作为可信的相关作用关系，并导入Cytoscape软件进行网络可视化分析。利用Cytoscape软件中network analyze功能中“generate style from statistics”的板块获取网络中靶标的自由度、介数、接近中心性和平均最短路径长度等信息，并按照自由度由小到大，颜色由黄到红进行注释，构建家禽热应激作用靶标间相互作用网络。

1.2.5.2 家禽热应激调控细胞凋亡作用靶标的筛选及相互作用关系的分析 家禽热应激作用靶标导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，基因类型选择Official Gene Symbol，物质信息和基因背景均选择Gallus gallus，进行GO富集分析，获得负调控细胞凋亡的作用靶标(negative regulation of apoptotic process)。将获得的热应激条件下调控细胞凋亡的作用靶标导入STRING数据库，获得靶标间相关作用关系网络和蛋白共表达间关系。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6 数据分析 所有试验均采用3个平行，数据以平均值±标准差(standard deviation，SD)表示。试验组之间的差异使用SPSS软件v.20.0，通过单向方差分析(ANOVA)和最小显著差异(LSD)多重比较测试方法分析。*和**分别表示P<0.05和P<0.01。

2 结果

2.1 热应激对受试鸡临床表现的影响

受试鸡遭受热应激4 h时，明显出现张口呼吸、剧烈喘息的表现，拒食、但饮水量增加；伴随热应激时间的增加，受试鸡的活动量减少，伏于笼底部；当热应激持续至2 d时，热应激的状态有所缓解，受试鸡饮食逐渐恢复，张口呼吸的症状也有所减轻；当热应激持续至5 d时，受试鸡的行为和呼吸基本恢复。

2.2 热应激对心肌损伤酶谱的检测结果

受试鸡血清内心肌损伤相关酶CK、CK-MB、LDH和AST在热应激条件下的动态变化如图1所示。由图1可以看出，热应激1 d会上调受试鸡血清中CK(P<0.01)和CK-MB(P<0.05)的水平；当热应激持续至3 d时，CK和CK-MB的水平有所恢复，与正常条件下的水平无差异；当热应激持续至5 d时，CK和CK-MB的水平均极显著高于热应激0 d组(P<0.01)。另外，热应激5 d会上调LDH(P<0.01)和AST(P<0.05)的水平。

A.肌酸激酶；B.肌酸激酶同工酶；C.乳酸脱氢酶；D.谷草转氨酶

2.3 热应激条件下受试鸡心肌组织的病理变化

热应激导致的鸡心肌组织的病理性损伤结果见图2。当受试鸡处于热应激环境时，心肌组织出现损伤，具体表现为热应激1 d会导致心肌细胞的颗粒变性(→)和空泡变性(↑)；当热应激持续至3 d时，颗粒变性和空泡变性加重；当热应激持续至5 d时，心肌细胞颗粒变性和空泡变性继续加重，并开始出现核浓缩、核深染为特点的坏死(←)。

2.4 热应激条件下受试鸡心肌组织中Hsp转录水平的动态变化

受试鸡心肌组织中Hsp的转录水平如图3所示。热应激会激活Hsp的转录，在遭受38 ℃热应激刺激时，持续至3 d时会上调Cryab(P<0.05)和Hsp70的转录水平，在热应激5 d时，Hsp60、Hsp70和Hsp90均呈现极显著上调(P<0.01)。

2.5 家禽热应激作用靶标间相互作用网络

基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库Gene检索板块，共获得与家禽热应激相关的基因靶标共198个，将其导入STRING数据库共获得1 514条相关作用关系，筛选评分≥0.7的相互作用关系有530条。530条相互作用关系导入Cytoscape软件，进行可视化分析，获得家禽热应激作用靶标间相互作用网络见图4，其中椭圆代表蛋白靶标，其颜色由黄-红按自由度升序标注。由图4可以看出DNAJC6、HSPA9、HSPA8、HSPA2、HSPA4、HSPA5、HSP90AA1、HSPH1、SUGT1、HSP90AB1、GAK和HSPA4L自由度较高，均≥21，在家禽遭受热应激时发挥重要的作用。

A.0 d；B.1 d；C.3 d；D.5 d。心肌细胞应激性病理损伤，颗粒变性(→)、空泡变性(↑)、细胞坏死(←)

A.cryab mRNA；B.hsp60 mRNA；C.hsp70 mRNA；D. hsp90 mRNA

椭圆代表蛋白靶标，其颜色由黄-红按自由度升序标注

2.6 家禽热应激调控细胞凋亡作用靶标的筛选及相互作用分析

将获得的与家禽热应激相关的198个基因靶标，导入DAVID数据库进行GO富集分析，筛选与调控细胞凋亡相互的作用靶标见表2。发现热休克蛋白家族成员CRYAA、HSP90AB1、HSP90B1、HSPA5、HSPD1、DNAJA1和DNAJC3均参与热应激条件下调控家禽细胞凋亡的进程。将获得的调控细胞凋亡的作用靶标导入STRING数据库，进行相互间作用分析，获得相互间作用网络见图5，获得靶标间共表达结果见图6。Hsp90AB1和Hsp90B1可以调控细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)，Hsp90AB1和HspD1可以与CDK1共表达，影响细胞周期。Hsp90B1、DNAJC3和IGF1可以调控白介素6(interleukin 6，IL-6)，影响细胞因子的表达，从而影响细胞凋亡。

表2 家禽热应激调控细胞凋亡的作用靶标

图5 热应激调控家禽细胞凋亡的靶标间相互作用网络

图6 热应激调控家禽细胞凋亡的靶标共表达网络

3 讨论

应激(stress)是一种由多种应激原作用于动物机体而造成机体非特异性损伤的反应。应激原在畜禽生长发育过程中普遍存在，如夏天高温时节的热应激、长途运输时的运输应激等。随着集约化养殖和全球气温变暖趋势的影响，热应激已经成为影响畜牧养殖业发展的重大因素之一。当环境温度超过各种动物的舒适区上限时，动物就会出现热应激反应，环境温度超过舒适区上限越高、持续时间越长，热应激反应的程度就越严重。2003年美国因热应激造成了1.69亿～ 23.6亿美元的损失[12]。在我国，大部分地区每年夏天都会出现超过各种家畜、家禽等热区上限的持续高温天气(35 ℃～40 ℃)，造成动物免疫力下降及各种疾病，甚至猝死。此外，热应激还会降低肉品品质，降低母猪的产奶量和仔猪的断奶重量[13-15]、肉鸡日增重[16-18]、蛋鸡体重和蛋壳厚度[19],引起火鸡的死亡率升高[20]。由于热应激与其他传染病的致病因素不同，其对动物机体的损害是非特异性的，引起的动物疾病甚至死亡因素并不单一，且目前尚无有效的解决和控制办法，因此研究热应激对动物机体的损伤机制以及动物机体的应答措施，对防止动物热应激损伤及筛选抗热应激药物具重要的实际意义。

心脏对热敏感。鲍恩东等[21]的研究中发现热应激可导致肉鸡的心肌纤维断裂等病理变化。热应激导致动物死亡的原因可能与热应激对心肌细胞的损伤有关。本试验结果显示，热应激1 d会导致心肌细胞的颗粒变性和空泡变性，该病理损伤会随热应激时间的持续而加重，在热应激持续5 d时，出现核浓缩、核深染为特点的坏死。细胞作为构成生命机体的基本单元，同样具有抗损伤的功能。当细胞受到应激刺激时，会启动自身的内源性保护机制来抵抗损伤。

动物细胞在受到应激刺激时会上调相关功能蛋白的基因转录水平，从而上调功能性蛋白质翻译水平，主要通过暂时的升高HSP的表达水平来增强细胞耐受性以及存活率。HSP作为重要的内源性保护机制参与蛋白，协助机体适应环境的变化，抵抗应激造成的损伤。各种应激刺激如缺氧、缺血、冷应激、热应激、创伤、感染等都可诱导HSP的表达。研究发现，HSP表达量与细胞抗损伤能力呈正相关，因此，HSP被认为是衡量机体抵抗外应激刺激能力的重要指标。HSP具有众多生物学功能。在大多数生物体中表达的CRYAB可作为分子伴侣稳定细胞骨架结构，并且参与细胞周期与凋亡通路的调控[22]。Hsp60主要分布在线粒体中，在各种胁迫条件下重新折叠或错误折叠的蛋白质中起重要作用[23]。Hsp70在抗细胞损伤中发挥重要作用，其诱导表达可以有效提高细胞存活率并减轻应激损伤[24]。热应激还诱导Hsp90高表达，Hsp90与促生存/抗凋亡信号转导途径密切相关，且Hsp90还可以帮助其客户蛋白维持其正确的分子结构[25]。本研究也发现38 ℃热应激，会在3 d时会上调Cryab和Hsp70的转录水平，在热应激持续5 d时，Hsp60、Hsp70和Hsp90均呈现极显著上调，这一结果也反映出HSP在细胞抵抗损伤过程中发挥着重要的作用。

细胞凋亡是细胞遭受损伤时发生的重要生物学过程，本研究发现热应激条件下，HSP在调控细胞凋亡中发挥着重要的作用，尤其是Hsp60、Hsp70和Hsp90家族。通过蛋白靶标间互作分析和共表达分析，发现Hsp90AB1和Hsp90B1可以调控CDK1，Hsp90AB1和HspD1可以与CDK1共表达，影响细胞周期。Hsp90B1、DNAJC3和IGF1可以调控白介素6(interleukin 6，IL-6)，影响细胞因子的表达，从而影响细胞凋亡。这一结果为探索HSP在抗热应激损伤的机制方面提供了理论依据。