口腔鳞状细胞癌中SALL4调控相关miRNAs的鉴定及其抑制肿瘤转移的机制*

晏燕，陈先卓，秘双燕，吴增波**

(1.川北医学院附属医院，四川 南充 637000；2.珠海拜博口腔医院，广东 珠海 519000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球最为常见的恶性肿瘤之一，而我国每年新发病例数占全球发病总数的50.0%，居国内恶性肿瘤死亡率第2位[1]。目前，临床上对于OSCC以手术治疗为主，通过手术能切除病灶组织，延缓病情发展，且随着外科技术、围术期处理水平的提高，OSCC手术成功率得到提高[2]。但是，OSCC患者预后较差，5年生存率仅为40%～50%，这可能与患者术后肿瘤的复发、转移有关[3]。已有临床研究表明，上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)在启动上皮来源肿瘤中发挥了重要的作用[4]。在EMT过程中，E钙黏蛋白、角蛋白等呈低表达，N钙黏蛋白、波形蛋白等呈高表达，且随着病情的不断发展，细胞会脱离细胞束缚而发生远处转移[5]。人婆罗双树样基因4(human borne double tree-like gene 4，SALL4)是新发现的含锌指结构的转录因子，在原始生殖细胞肿瘤中呈特异性表达，并在早期胚胎发育过程中发挥了重要的作用[6]。既往研究表明，SALL4启动子为STAT3结合区，具有激活细胞自我更新、胚胎干细胞功能调节能力，其传导通路与肿瘤细胞基因表达存在紧密联系，但是其具体作用机制及在肿瘤转移中的作用尚未阐明[7]。因此，本文采取细胞对照方法进行研究，探讨OSCC中SALL4调控相关miRNAs的鉴定及其抑制肿瘤转移机制，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 OSCC Tca8113细胞系购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.1.2主要试剂与仪器 青-链霉素胎牛血清、改良Eagle培养基(dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)及高糖培养基(美国hyclone)，β-actin抗体(美国Santa Cruz)，LipfectmineTM2000转染试剂(美国Invitrogen)，SALL4 RNA逆转录试剂盒(美国Ambion)、噻唑蓝(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)试剂盒(日本同仁)，7500聚合酶链式反应基因扩增仪(美国ABI)，凝胶成像分析系统(北京六一)，细胞培养板(美国Gibco)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 OSCC Tca8113细胞接种于10%胎牛血清RMPI-1640培养基中，置37 ℃的5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合80%后对细胞进行传代培养，取第2代对数生长的细胞，备用。

1.2.2半定量逆转录多聚酶链式反应(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法测定SALL4调控相关miRNAs表达 构建负载miRNA前体序列的慢病毒重组体转染Tca8113细胞，上、下调Tca8113细胞内miRNA表达丰度，分别设为上调组与下调组，以单纯Tca8113细胞作为对照；取处理后的细胞，加 trizol 500 μL充分混合均匀，加氯仿0.2 mL，15 s剧烈震荡，常温静置2～3 min，3 500 r/min离心15 min[8-9]；取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加异丙醇0.5 mL，混合均匀置于-20 ℃冰箱，1 194 g离心10 min；充分洗涤RNA沉淀，加入DEPC 250 μL与乙醇750 μL，4 500 r/min离心5 min，取沉淀置工作台干燥20 min；利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯(以Rnase作为空白对照)，在A260下测定吸光度值；采用Dnase酶处理RNA，处理完毕后放入冰箱中；利用RT-PCR完成转染前后SALL4mRNA表达水平(表2)，设定PCR反应条件为30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min，连续35个循环，72 ℃、10 min延长；选择获得的扩增产物，放入1.5%琼脂凝胶进行电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定，β-actin为内对照[10]。实验所用印务序列见表1。

表1 实验中所用引物

1.2.3Western blot方法检测SALL4蛋白表达 分别取OSCC Tca8113的细胞，PBS连续洗涤3次，加RIPA后置冰上裂解30 min，4 ℃下2 500 r/min离心30 min，收集上清液，采用免疫组织化学蛋白定量(bicinchoninic acid，BCA)法定量测定蛋白含量；10.0%SDS-PAGE电泳分离蛋白，对半干转法，速度1 000 r/min离心20 min，电转移到PVDF膜封闭2 h；加SALL4蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，TBS-T洗膜5次，5 min/次；加SALL4蛋白二抗连续孵育2 h，过夜，TBS-T 5次洗膜，5 min/次，加少许ECL增强化学检测试剂，分子成像仪上获得结果；利用双荧光素酶报告系统进一步验证miRNA对SALL4的靶向调控，经过鉴定的miRNA记为miRNA-S[11]。

1.2.4Transwell小室测定细胞侵袭能力 miRNA(miRNA-S)的前体序列载体，转染Tca8113细胞，检测SALL4调控相关的miRNA对Tca8113细胞侵袭、迁移能力的影响。将细胞放置于无血清培养基，调整细胞浓度为2×108个/L，备用；常规消化、离心后调整细胞密度为2×108个/L，取细胞悬液200 μL轻轻加入Transwell小室，再加10.0%血清DMEM培养液600 μL，待细胞沉到小室底膜后，小室整体放入培养箱，连续培养12 h；取出Transwell小室，去除室内培养基，4%多聚甲醛固定10 min，采用PBS溶液冲洗，采用结晶紫色染色液染色3 min，医用棉棒轻轻擦拭小室膜上表面未穿过的细胞，PBS冲洗小室；载玻片上加PBS，置于小室上方，倒置显微镜下拍照，随机取5个高倍镜视野下，计算细胞穿过底膜的细胞数量，并分析细胞的迁移和侵袭数目[12-13]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SALL4 mRNA表达

结果显示，上调组Tca8113细胞中SALL4 mRNA表达水平均高于下调组和对照组，下调组则低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组Tca8113细胞中SALL4 mRNA的表达

2.2 SALL4蛋白表达

结果显示，上调组、下调组Tca8113细胞中SALL4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于对照组且差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与对照组比较，P<0.05。

2.3 SALL4调控相关miRNAs的鉴定

结果显示，双荧光素酶报告系统进一步验证miRNA 对SALL4 的靶向调控，经过鉴定的miRNA 记为miRNA-S。见图2。

注：1、2及3分别为对照、miRNA及miRNA-S泳道。

2.4 细胞侵袭能力

结果显示，上调组、下调组Tca8113细胞干预后迁移及侵袭细胞数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；但均少于对照组，且差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组Tca8113细胞迁移和侵袭数目的比较

3 讨论

OSCC是临床上常见的恶性肿瘤，且随着人们生活方式方式的改变，导致疾病发生率呈上升趋势，影响患者健康和生活[14]。临床研究表明，OSCC的发生、发展是一个多因素过程，普遍认为与个体遗传基因、不良生活习惯、肿瘤的预防及筛查有关，亦与原癌和抑癌基因失衡有关，导致基因发生突变或失活，引起恶性肿瘤复发率较高[15-16]。目前，临床上对于OSCC以手术切除为主，利用手术能切除病灶组织，延缓病情发展，但是患者远期治疗预后较差，术后复发率较高[17-18]。SALL4是人体中常见的基因，能伴随着组织、器官的成熟而成熟，其表达数量将呈下降趋势[19]。但是，恶性肿瘤患者SALL4基因数量较高，能直接参与肿瘤的发生、发展[20]。本研究中，上调组Tca8113细胞中SALL4 mRNA表达水平均高于下调组和对照组(P<0.05)，对照组SALL4 mRNA表达水平低于下调组(P<0.05)，说明SALL4在OSCC患者中呈高表达，能直接参与疾病的发生、发展。

在人体内，SALL4基因突变常涉及多个器官缺陷的常染色体显性疾病[21]。国外学者研究表明，在白血病、胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肝癌或子宫内膜癌患者中SALL4基因多呈高表达[22-23]；同时在正常人体血液系统中，SALL4在CD34阳性造血干/祖细胞中均呈高表达，随着造血细胞成熟后，SALL4基因表达水平结果处于异常状态[24-25]。为了进一步确定SALL4调控相关miRNAs在OSCC中的作用，本研究中采用双荧光素酶报告系统进一步验证miRNA对SALL4的靶向调控，经过鉴定的miRNA记为miRNA-S；上调组或下调组细胞干预后期迁移及侵袭细胞数比较差异均无统计学意义(P>0.05)；上调组或下调组干预后细胞的迁移及侵袭细胞数均少于对照组(P<0.05)，由此看出SALL4调控相关miRNAs在OSCC中以miRNA-S表达为主，能抑制口腔鳞状细胞的增殖、生长，从而能延缓病情发展。

综上所述，SALL4调控相关miRNAs在OSCC细胞中呈低表达，能抑制肿瘤细胞的侵袭、转移，有望成为OSCC治疗新靶点。