TLR3激动剂对体外NK细胞抗肿瘤活性的影响及机制*

廖春香，安媛媛，车启元，陈亮，龙世棋，王念雪，杨薇，赵星*

(1.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 基础医学院 免疫学教研室，贵州 贵阳 550004；3.安顺市人民医院 胸甲乳外科，贵州 安顺 561000；4.贵州医科大学 临床医学院 肿瘤学教研室，贵州 贵阳 550004)

自然杀伤细胞(natural killer，NK)是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏[1-2]。在正常情况下，NK细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)Ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞[3-4]。活化的NK细胞可以通过分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、穿孔素(perforin)、趋化因子等调节机体的抗肿瘤免疫应答[5]。IFN-γ可通过促进Th1应答、抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞表达主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子(major histicompatibility complex，MHC-Ⅰ)等发挥重要的抗肿瘤作用[6-7]。NK细胞释放的perforin是一种具有成孔作用的溶细胞蛋白，在NK细胞脱颗粒时，perforin可以结合到靶细胞的质膜上，并以钙离子依赖的方式聚集，在靶细胞上形成孔并允许颗粒酶扩散到靶细胞中，使靶细胞发生裂解，perforin被认为是T细胞和NK细胞介导的溶细胞作用的关键效应分子[8]。目前，NK细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5%～15%[9]，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的NK细胞在肝癌[10]、胶质母细胞瘤[9]、白血病[11]等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。本研究探讨TLR3激动剂 Poly(I ∶C)转染对体外扩增的人NK细胞抗肿瘤活性的影响及可能机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂

1.1.1细胞(株) 人结直肠癌细胞株DLD-1细胞购自中国典型培养物保藏中心(China center for type culture collection, CCT-CC)，人NK细胞根据本课题组前期已建立的方案进行体外扩增[12]并冻存备用。

1.1.2主要试剂 RPMI 1640、MEM、Opti-MEM减血清培养基及青霉素、链霉素、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司，高分子量Poly(I ∶C，HMW)购自美国InvivoGen公司，Lipo3000购自赛默飞公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，流式检测所用的抗人FITC-CD69抗体、抗人PE-CD56抗体及相关试剂购自BioLegend公司，人perforin及人TNF-α的ELISA检测试剂盒均购自美国Abcam公司，人IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自BD公司，TLR3/dsRNA complex inhibitor购自德国Merck公司，TBK1/IKKε抑制剂BX795购于Abcam公司，DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)购自 Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1Poly-NKelect.组及Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率 液氮罐中复苏一支人NK细胞，细胞量约为2×108个，复苏后加入完全培养基100 mL将细胞浓度调整为2×106个/mL，在37 ℃，5%CO2培养箱中放置2 h备用。Poly-NKelect.组细胞是将5×106个NK细胞用250 μL减血清Opti-MEM培养基重悬后转移至电转杯内(避免产生气泡)，放入Celetric电转仪中，电转条件为380 mV、30 ms，电转结束后加入完全培养基调整细胞浓度为2×106个/mL，置于温箱中备用(Poly-NKelect.组)。在1.5 mL离心管中加入培养基500 μL，再加入脂质体2 μL，再加入等体积Poly(I ∶C)，充分混匀后室温静置30 min后与浓度为2×106个/mL的NK细胞共孵育过夜(Poly-NK组)，Poly(I ∶C)终浓度为10 mg/L，设置单独NK细胞作为对照组(NK组)。次日将3组细胞轻轻混匀，准备3支15 mL离心管并标记，用200目细胞过滤网过滤后于离心机中950 rpm，离心10min，台盼蓝染色计算细胞存活率后将细胞浓度调整为3×106个/mL备用。以DLD-1细胞为靶细胞，Poly-NKelect.细胞、Poly-NK及单独NK细胞作为效应细胞，先在96孔U型反应板中加入浓度为6×105个/mL的DLD-1细胞，100 μL/孔，于操作台中静置约5 min，按照5 ∶1的效靶比加入浓度为3×106个/mL 的3中不同处理方式的NK细胞，100 μL/孔，用培养基补至终体积为200 μL，每组3个复孔，同时设置单独培养基为空白对照组，置于温箱内作用5 h后加入20 μL/孔的CCK-8溶液，置于细胞培养箱内反应2.5 h后，用酶标仪检测各孔光密度(optical density，OD)值，NK细胞杀伤效应用死亡率(%)表示，细胞死亡率(%)=[1-(效靶细胞孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100%。

1.2.2Poly-NK组及Poly-NK+BX组细胞对DLD-1细胞的杀伤 根据“1.2.1”项下选择Poly-NK进行后续实验。根据文献查阅及前期实验摸索，选择BX795抑制剂的浓度为10 μmol/L[13]。为验证在BX795的推荐浓度下DMSO对实验的安全性，设置了相同体积的DMSO作为溶剂对照组(NK+DMSO组)，将抑制剂先加入单独的NK细胞中孵育30 min，再加入Poly(I ∶C)置于37 ℃含5% CO2的温箱中孵育过夜。次日接板及计算方法同1.2.1。

1.2.3Poly-NK及Poly-NK+BX细胞的表面活化标志物CD69的表达 调整Poly-NK及Poly-NK+BX组细胞浓度为1×106个/mL，设单独NK细胞组作为对照，按每管1 mL分装到1.5 mL离心管内，离心去上清后用PBS重悬，每管加入Fc封闭液5 μL，室温封闭20 min后加入抗人FITC-CD69、抗人PE-CD56流式抗体3 μL，25 ℃下避光孵育30 min，离心，用1×PBS清洗2遍，200目细胞筛过滤，用贝克曼FC500流式细胞仪进行检测，用Flowjo VX软件进行分析。

1.2.4Poly-NK组、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.组细胞perforin、IFN-γ以及TNF-α的分泌水平 将perforin、IFN-γ、TNF-α的ELISA试剂盒提前30 min恢复至室温，按说明书配制洗涤液、抗体稀释液、标准品稀释液等，将收集的NK细胞对照组、Poly-NK组、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.组细胞培养上清液1 500 r/min，离心10 min，每孔加入100 μL上清液，每组设3个复孔和3个标准品孔，按照说明书进行操作，最后用酶标仪检测标准品的OD值，并根据标准品的浓度与OD值关系作出拟合曲线，根据回归方程计算出各组样本中perforin、IFN-γ及TNF-α的浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Poly-NKelect.和Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率

Poly-NKelect.及Poly-NK组细胞的存活率比较[(70±3.12)%vs(71±1.4)%]，差异无统计学意义(P>0.05)。与Poly-NKelect.组比较，Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率更高[(41±2.03)%vs(63±1.1)%，P<0.01]，因此后续Poly(I ∶C)活化NK细胞的实验中均采用Poly-NK组进行实验(图1)。

注：(1)与NK组相比，P<0.01；(2)与NK组相比，P<0.05。

2.2 Poly-NK和Poly-NK+BX组对DLD-1细胞杀伤率

与Poly-NK组比较，Poly-NK+BX组对DLD-1细胞的杀伤率降低，差异具有统计学意义[(75±2.22)%vs(61±3.58)%，P<0.01]；与NK组比较，NK+DMSO组细胞存活率无明显变化，差异无统计学意义[(47.58±0.91)%vs(46.43±1.02)%,P>0.05]。见图2。 提示TBK1/IKKε抑制剂能降低Poly(I ∶C)转染人NK细胞的抗肿瘤活性。

注：与NK组相比，(1)P<0.05;(2)与Poly-NK组比较，P<0.01。

2.3 Poly-NK和Poly-NK+BX组NK细胞表面CD69的表达

与NK组比较，Poly-NK组CD69表达上升[(58.3%vs70.5%)，P<0.05]，且平均荧光强度增强[(5 000±25.12)%vs(6 789±32.11)%)，P<0.01]；与Poly-NK组相比，Poly-NK+BX组CD69的表达降低[(60%vs70.5%)，P<0.05]，且平均荧光强度减弱[(6 789±32.11)%vs(5 025±18.43)%，P<0.05]。见图3，提示TBK1/IKKε抑制剂BX795能降低Poly(I ∶C)转染的NK细胞CD69的表达。

注：A为NK细胞CD69分子阳性率的检测，B为对应的平均荧光强度；(1)与NK组比较，P<0.01;(2)与Poly-NK组相比，P<0.05。

2.4 Poly-NK组及Poly-NK+BX组细胞perforin及IFN-γ的表达

与NK组比较，Poly-NK组perforin和IFN-γ表达增加[(815±4.38)%vs(886±5.33)%，(32±1.31)%vs(142±1.22)%，P<0.05]；与Poly-NK组比较，Poly-NK+BX组perforin、IFN-γ表达降低[(691±4.28)%vs(886±5.33)%，(56±2.33)%vs(142±1.22)%，P<0.05]。见图4，提示Poly(I ∶C)活化的NK细胞抗肿瘤作用与TBK1/IKKε抑制剂相关。

注：(1)与NK组比较，P<0.05;(2)与Poly-NK组比较，P<0.05。

2.5 Poly-NK组及Poly-NKinhib.组细胞中TNF-α及IFN-γ的表达

与NK组比较，Poly-NK组TNF-α、IFN-γ表达增加[(192±1.22)%vs(252±1.35)%，(27±1.57)%vs(82±1.29)%，P<0.05]；与Poly-NK组比较，Poly-NKinhib.组TNF-α、IFN-γ表达降低[(252±1.35)%vs(187±1.33)%，(82±1.29)%vs(37±2.11)%，P<0.05]。见图5，提示Poly(I ∶C)活化的NK细胞抗肿瘤作用与TLR3/dsRNA复合物抑制剂相关。

注：(1)与NK组比较，P<0.05；(2)与Poly-NK组比较，P<0.05。

3 讨论

模式识别受体(pattern-recognition recap-tors，PRRs)是机体识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern，DAMPS)的一类受体，可识别dsRNA的PRRs包括黑色素瘤分化相关基因-5(melanoma different-tiation-associated gene-5，MDA-5)、视黄酸诱导基因-1(retinoic-acid inducible gene-1,RIG-1)以及Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)等[13-16]。TLR3作为一种可以识别病毒dsRNA的受体，在识别病毒dsRNA后可引起Ⅰ型干扰素(type I interferon，IFN-Ⅰ)的分泌，诱导干扰素调节因子-3(Interferon regulatory factor-3，IRF-3)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)转录因子的激活，TANK结合激酶-1(TANK binding kinase 1,TBK1)及NF-κB抑制蛋白激酶-ε(nuclear factor kappa B inhibits protein kinase，IKKε)作为TLR3信号通路下游的信号分子，在dsRNA激活 TLR3通路后被活化并参与IFN的产生，诱导机体的抗病毒、抗肿瘤免疫[17-18]。有研究发现，TLR3的激活可抑制黑色素瘤荷瘤鼠的肿瘤肺转移[19]，抑制膀胱癌荷瘤鼠的肿瘤生长[20]。dsRNA类似物聚肌胞苷Poly(I ∶C)是一种人工合成的TLR3激动剂，被认为是TLR3的配体而被TLR3识别，可以活化树突状细胞[13, 21]，现已作为治疗性疫苗佐剂用于黑色素瘤和乳腺癌的治疗进入了Ⅱ期临床试验[22-25]。

在此次研究中，探讨了Poly(I ∶C)对NK细胞的活化作用及可能的机制。结果显示，TLR3激动剂Poly(I ∶C)转染人NK细胞后促进了NK细胞的细胞毒作用，在抗肿瘤活性增强的同时伴随IFN-γ、perforin及TNF-α分泌增加、NK细胞活化标志物CD69的上调。而在TLR3/dsRNA复合物抑制剂或TBK1/IKKε抑制剂BX795的作用下，NK细胞抗肿瘤活性降低，IFN-γ、perforin及TNF-α分泌减少，NK细胞活化标志物CD69表达下调，即Poly(I ∶C)以TLR3及TBK1/IKKε依赖的方式促进NK细胞的杀伤能力并促进分泌perforin、IFN-γ及TNF-α。以上结果提示Poly(I ∶C)活化的NK细胞抗肿瘤作用可能与TLR3信号通路的活化有关。本研究虽然证实TLR3通路在NK细胞抗肿瘤中发挥重要的作用，但NK细胞还可以通过MDA-5和RIG-1等PRRs来识别dsRNA发挥抗肿瘤效应，因而还需深入探讨Poly(I ∶C)促进NK的抗肿瘤活性的相关机制，从而为探索在肿瘤的免疫治疗中如何通过Poly(I ∶C)等PRRs激动剂来增强NK细胞抗肿瘤活性奠定理论及实验基础。