抗氧化剂改善卵巢功能的研究进展

覃颖

卵巢功能减退(premature ovarian insufficiency,POI)和卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)所导致的生育力下降以及由于雌激素缺乏所引发的围绝经期症状严重影响了患者的身体、心理健康[1]。随着现代社会女性结婚生育年龄的推后，如何改善高龄女性的卵巢功能以提高受孕成功率成为目前备受关注的难点问题。研究发现卵巢早衰与自身免疫紊乱有关，但是卵巢功能减退并非是绝对不可逆的过程，通过免疫治疗等干预手段有望改善卵巢功能[2]。此外，放疗及化疗虽然提高了女性癌症患者的生存率，但也严重损伤卵巢组织加速卵巢功能衰竭。目前提出在女性癌症患者接受放化疗之前将她们的卵子、胚胎或卵巢组织进行冷冻保存，待化疗结束后再移植回患者体内以避免放化疗对卵巢损伤的治疗方案[3]。这一方案虽具有一定的可行性，但也存在局限性。首先胚胎冷冻不适用于未婚女性。其次无论是卵子或是胚胎的冷冻，都必须经历一定时间的促排卵，这势必会耽误某些重症癌症患者的有效治疗时机。卵巢组织冷冻保存可以弥补胚胎及卵子保存的局限性，但是目前卵巢移植的成功率较低且存在移植回体内后导致癌症复发的风险，而在卵巢组织体外培养方面仍存在较大的技术瓶颈，因此限制了此方案的应用。

因此，需要探索更多有效安全可行的方案去改善女性患者的卵巢功能及生育能力。氧化应激(oxidative stress,OS)加速人体内各脏器细胞的老化和凋亡，大量的研究表明卵巢功能的衰竭与氧化应激有关，尤其在女性随着年龄增长所伴随的卵巢功能减低过程中，氧化应激是其中不可忽视的重要因素。医源性因素(放化疗等)以及生活习惯和环境因素导致的氧化应激也有可能损伤卵巢功能及生育能力[4]。此外,多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)所伴随的胰岛素抵抗及糖脂代谢异常也能诱发机体及卵巢内的氧化应激损伤，从而影响卵泡发育及排卵[5]。因此应用有效的抗氧化剂有望改善由于高龄、放化疗、多囊卵巢综合征及各种环境因素所导致的卵巢功能损伤。以下我们将详细阐述氧化应激如何诱发卵巢衰竭，以及几种常见抗氧化剂的作用机理和研究进展。

一、氧化应激诱发卵巢功能衰竭

1.氧化应激的产生：在机体和细胞的生理代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H202)。同时，机体和细胞内部也存在内源性抗氧化体系，它们主要包括作为活性氧清除剂的谷胱甘肽(glutathione，GSH)，以及抗氧化物酶类的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase，GST)等。在正常状态下，足量的内源性抗氧化体系能清除大部分的ROS，即细胞内的ROS与内源性的抗氧化体系成动态平衡[4]。但是在异常状态下，比如高龄所导致的机体和细胞内过量的ROS产生和GSH、MnSOD等抗氧化酶的缺失，或者由于放化疗过程中或是长期高脂饮食导致体内过量的ROS产生，都会打破ROS与抗氧化体系之间的平衡，导致过量的无法清除的ROS囤积在细胞内，形成有害的氧化应激状态。

2.氧化应激加速卵巢功能衰竭：细胞内低浓度的ROS可以刺激细胞生长，而远大于内源性抗氧化体系清除能力的ROS会导致高浓度的ROS囤积在细胞内，演变为有害的氧化应激，损伤细胞并加速细胞老化及凋亡[4,6]。氧化应激会损伤线粒体DNA，导致线粒体功能紊乱，使线粒体摄取Ca2+增加，高浓度的Ca2+会抑制线粒体合成ATP，ATP的缺乏影响细胞生长甚至导致凋亡。此外，氧化应激导致线粒体内的细胞色素C释放到细胞浆，进而激活了caspase-3所诱发的细胞凋亡[6-7]。

从青春期开始的第一次减数分裂再启动促使始基卵泡陆续募集发育为初级卵泡进而进入接下来的生长阶段，我们将次级卵泡及小的窦状卵泡统称为生长阶段卵泡，之后优势卵泡排卵完成第一次减数分裂，成功受精后完成第二次减数分裂。在正常生理状态下，ROS与内源性抗氧化体系处于动态平衡,当始基卵泡发育到生长阶段卵泡后，生长阶段卵泡内的颗粒细胞会分泌大量的始基卵泡活化抑制因子，从而抑制始基卵泡的募集，从而使卵巢卵泡池内的始基卵泡数量维持在正常范围。然而，各种因素所诱发的氧化应激会损伤卵巢内的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞，其中颗粒细胞对氧化应激损伤最为敏感，同时处于减数分裂活跃状态的卵母细胞比处于休止状态的卵母细胞更容易遭受氧化应激损伤[8]。因此，富含颗粒细胞且处于活跃状态的生长阶段卵泡受氧化应激损伤最严重最易发生凋亡，损伤凋亡使其分泌的始基卵泡活化抑制因子显著减少，促进了始基卵泡的募集，从而间接诱导了始基卵泡储备量的丢失。此外，在高强度氧化应激状态下，也可以直接刺激一些耐受力弱的始基卵泡凋亡。因此，氧化应激间接或是直接地加速了始基卵泡储备的丢失，诱发卵巢功能衰竭。

二、抗氧化剂改善卵巢功能生育力

对抗氧化应激所导致的卵巢功能损伤，关键在于恢复ROS与抗氧化体系的动态平衡，一方面减少ROS的生成，另一方面刺激内源性抗氧化体系活性或是补充外源性抗氧化物质以增强清除ROS的能力。到目前为止，众多的研究者在此课题上取得了显著的研究成果，以下我们将介绍几种疗效突出有较好研究前景的抗氧化剂。

1.褪黑素(melatonin)：褪黑素是一类由松果体腺细胞合成及分泌的吲哚类激素。已有大量研究表明褪黑素因为其明显的抗氧化效应可以用于防治衰老、缺血再灌注损伤及放射治疗等所导致的氧化应激损伤。褪黑素能直接清除活性氧自由基，促进谷胱甘肽的合成，减轻氧化应激对线粒体蛋白及DNA的损伤[9]。有研究者指出人类卵泡液内的褪黑素能缓和氧化应激从而保护卵母细胞和颗粒细胞，而高龄女性的卵泡液内的褪黑素会显著减少[10]。研究表明褪黑素能抑制顺铂(cisplatin)所导致的雌性小鼠始基卵泡池储备的丢失。顺铂激活细胞内的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号转导通路，使AKT磷酸化(AKT的活化)，AKT的磷酸化又会促使转录因子叉头框蛋白O3a(forkhead Box O3a，FOXO3a)磷酸化(无活性状态)，从而使具有活性的非磷酸化形式的FOXO3a明显减少。而沉默信息调节因子1(sirtuin1,SIRT1)通过使FOXO3a去乙酰化从而激活细胞核内的MnSOD及过氧化氢酶(catalase)，以达到清除活性氧的作用。因此顺铂导致的PI3K/AKT通路的激活会抑制FOXO3a介导的抗氧化效应，诱发氧化应激损伤卵泡内的细胞。给小鼠注射褪黑素后，明显抑制了顺铂所诱发的PI3K/AKT通路的激活，抑制了AKT的磷酸化，增强了非磷酸化形式的FOXO3a介导的抗氧化效应(图1)，从而缓解了顺铂导致的始基卵泡储备的丢失[11]。

2.1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)：S1P来源于鞘脂类，而鞘脂类不仅是生物膜的重要组成成分，还调节着细胞生命活动中的信号转导过程。有研究指出S1P可以抑制H202诱发的人颗粒细胞的凋亡[12]。氧化应激可以促进神经酰胺(ceramide)的合成，高龄女性卵巢内神经酰胺含量显著增加，而神经酰胺是诱发细胞凋亡的途径之一，S1P可以通过抑制神经酰胺的活性从而抑制高龄女性卵巢卵母细胞的凋亡[13]。S1P还可以通过抑制神经酰胺的活性来抑制环磷酰胺(cyclophosphamide)和阿霉素(doxorubicin)所导致的人始基卵泡的丢失[14]。氧化应激会损伤线粒体内膜及内膜上参与电子传递的线粒体蛋白，使电子传递过程中电子漏出导致大量ROS的产生。同时，氧化应激会损伤线粒体DNA，导致维持线粒体功能的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)活性降低，并且抑制MnSOD和GSH的生成，进一步加重氧化应激。S1P可以增强线粒体内膜防御氧化应激损伤的能力，抑制电子漏出导致的ROS的生成，同时S1P可以激活PGC-1α，增强线粒体的功能以防御氧化应激[15-16](图1)。

3.三氯合碲酸铵(AS101)：三氯合碲酸铵[(ammonium trichloro(dioxoethylene-o,o′)tellurate，AS101)]是一种人工合成的低分子量的含碲化合物，其作为免疫调节剂目前在临床试验阶段用于增强肿瘤患者的免疫功能。最近有研究发现AS101能够抑制环磷酰胺所导致的线粒体内MnSOD的失活和GSH生成减少，即增强了MnSOD和GSH的抗氧化效应，同时AS101还增强了PGC-1α的活性改善了线粒体功能，最终抑制了环磷酰胺所导致的小鼠始基卵泡储备的下降[17]。此外，与褪黑素相似，AS101也可以抑制氧化应激对 PI3K/AKT信号转导通路的激活，从而抑制AKT及FOXO3a磷酸化，使得具有活性的非磷酸化的FOXO3a效应增强，进而激活MnSOD及catalase(图1)，最终实现抑制氧化应激导致的生长卵泡的凋亡，从而抑制了始基卵泡的募集[18]。

4.辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)：CoQ10是线粒体内膜上电子传递链的组成部分，参与电子的传递和ATP的生成。因此，随着年龄增长导致的CoQ10的缺失，或是氧化应激直接损伤线粒体内膜上的CoQ10，都会影响正常的电子传递导致电子漏出，使ROS大量生成。此外，CoQ10可以激活线粒体内的MnSOD活性，增强抗氧化能力[19](图1)。研究表明CoQ10可以抑制顺铂导致的大鼠卵泡的大量闭锁，并且增强了卵泡内AMH(anti-Müllerian hormone)的表达。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)作为反映DNA氧化损伤的生物标记物，顺铂使大鼠卵泡内的8-OHDG表达增加，而CoQ10的添加可以抑制8-OHDG的表达，表明CoQ10可以抑制顺铂诱发的氧化应激损伤[20]。有研究表明CoQ10的添加能提高IVF-ICSI助孕过程中卵巢低反应患者的获卵率、受精率及胚胎质量[21]。

图1 几种常见抗氧化剂对抗氧化应激的作用机制示意图 OS：oxidative stress/氧化应激；ROS：reactive oxygen species/活性氧；PI3K：phosphatidylinositol3-kinase/磷脂酰肌醇3-激酶；AKT：serine/threonine kinase/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；melatonin：褪黑素；P:phosphorylation/磷酸化作用；FOXO3a：forkhead Box O3a/叉头框蛋白O3a；SIRT1:sirtuin1/沉默信息调节因子1；MnSOD：manganese superoxide dismutase/锰超氧化物歧化酶；catalase：过氧化氢酶；S1P：sphingosine-1-phosphate/1-磷酸鞘氨醇；AS101；ammonium trichloro(dioxoethylene-o,o′)tellurate/三氯合碲酸铵；CoQ10：coenzyme Q10/辅酶Q10；GSH：glutathione/谷胱甘肽；PGC-1α：peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α；Mitochondrion：线粒体；Nucleus：细胞核；Cytoplasm：细胞浆

各种因素所诱发的氧化应激可以激活细胞内PI3K/AKT信号转导通路，通过使AKT磷酸化(P)来可以抑制FOXO3a活性，从而抑制了FOXO3a在SIRT1去乙酰化作用下对锰超氧化物歧化酶(MnSOD)及过氧化氢酶(catalase)的激活作用。而褪黑素(melatonin)及AS101可以通过抑制PI3K/AKT转导通路来活化FOXO3a，从而激活MnSod及过氧化氢酶。另一方面，氧化应激可以损伤线粒体使其呼吸链电子漏出导致线粒体内活性氧的产生，同时氧化应激可以抑制线粒体内MnSOD和谷胱甘肽(GSH)的生成以及PGC-1α蛋白的表达，从而进一步加剧了氧化应激对线粒体的损伤。而melatonin、S1P、AS101和CoQ10可以保护线粒体的结构及功能，增强线粒体内的MnSOD、GSH及PGC-1α，从而抑制氧化应激对线粒体的损伤。

5.其它类型抗氧化剂：白藜芦醇(resveratrol)是一种提取自葡萄的天然多酚类化合物。研究者在大鼠实验中发现六价铬(Hexavalent chromium)显著降低了作为细胞质中抗氧化物酶的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 1，GPx1)及抗凋亡蛋白的表达量，从而加剧卵巢组织内的氧化应激、导致卵泡内颗粒细胞及卵母细胞的凋亡及卵泡闭锁。而白藜芦醇的添加可以明显上调GPx1的表达，缓和卵巢内的氧化应激以及卵泡的闭锁与凋亡[22]。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一种硫醇类抗氧化剂，其主要作用为干扰自由基的生成及清除已生成的自由基。有研究表明在人胎儿卵巢组织体外培养液中添加N-乙酰-L-半胱氨酸能促进卵泡的进一步发育[23]。此外，口服NAC也有可能改善PCOS患者的高胰岛素素血症及胰岛素抵抗[24]。作为一种天然的抗氧化剂，维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽，同时还原型谷胱甘肽有助于稳定还原型维生素C从而维持维生素C的抗氧化活性。维生素E通过与脂氧自由基反应从而阻断脂过氧化物的生成，并且它能与维生素C协同增强各自的抗氧化能力[25]。

综上所述，以上几种抗氧化剂能有效的防御氧化应激对卵巢及卵泡的损伤，从而保存了始基卵泡的储备，并维持卵巢正常的生理功能，因此有望成为改善高龄或是放化疗及多囊卵巢综合征所导致的卵巢损伤的一项有前景的治疗方案。但是仍然需要更多的研究尤其是临床试验进一步验证它们的有效性和安全性。此外，氧化应激损伤不仅局限于卵泡的生长成熟过程，还涉及受精、胚胎发育着床的过程；不仅作用于卵巢，还可作用于子宫内膜，因此应用抗氧化剂以防御氧化应激对女性整个生育过程的影响，有望提高受孕成功率[4,15,21]。