超高效液相色谱串联质谱法同时测定走川骨刺酊中3种乌头类生物碱含量*

庞小莲，刘吉成，林 生，周成忠，曾海清

（1.广西壮族自治区玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林537000；2.广西壮族自治区南宁市食品药品检验所，广西 南宁530007；3.广西实正药业有限公司，广西 玉林537000）

中成药走川骨刺酊由天南星、水半夏、草乌等7味药材经渗漉法提取而成，主要功效有活血祛瘀、通络止痛，常用于瘀血阻滞所致骨痹（骨质增生症），症见关节疼痛或刺痛，痛处固定，活动不利，面色晦暗，唇舌紫暗，脉沉或细涩等。处方中主要药材草乌的主要成分为二萜类生物碱，包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等，既是有效成分又是毒性成分［1］。产地、采收时间和炮制方法不同时，药材毒性成分含量存在较大差异［2-4］。成人口服纯乌头碱0.2 mg即可引起中毒，3～5 mg可致死［5-8］。本品虽为外用，但使用过程中若有不慎即可引起中毒。目前含有乌头类药材中成药的研究中，多数仅规定了乌头碱的含量限度［9-10］。为了保证产品质量及安全，本试验中采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定走川骨刺酊中3种乌头类成分含量，为产品的质量评价和质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱仪，Waters Xevo TQ-S型三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；LC/MS30-1-E型氮气发生器（英国Domnick Hunter公司）；3K15型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；XS-205DU型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500GDV型恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

走川骨刺酊（广西实正药业有限公司，批号分别为201408101，201407101，201503101，201608101，201611101，201612101，201612102，201612103，201703101，201705101）；乌头碱对照品（批号为110798-201307，纯度98.8%）、次乌头碱对照品（批号为110720-201111，纯度98.8%），新乌头碱对照品（批号为110799-201106，纯度98.4%），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲酸均为色谱纯，氨水、甲醇、盐酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18柱［11］（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～4 min时90%A→60%A，4～4.5 min时60%A-90%A，4.5～6 min时90%A［11］；流速为0.25 mL/min［12］；进样量为10μL；柱温为35℃。

质谱条件：离子源模式为电喷雾离子源（ESI）、正离子模式，扫描类型为多反应监测（MRM），毛细管电压1.8 kV。离子源温度为100℃，锥孔氮气流速为150 L/h，碰撞气为氩气，脱溶剂气氮气流速为650 L/h，脱溶剂气温度为350℃，四极杆作为质量分析器［13-14］。定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表1［15］。

表1 3种乌头类生物碱MRM参数Tab.1 MRM parameters of three kinds of aconitum alkaloids

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取乌头碱对照品9.31 mg、次乌头碱10.65 mg，精密称定，各置25 mL容量瓶中，取新乌头碱10.30 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，均用甲醇溶解并定容，得单一对照品贮备液；分别精密量取0.125 mL，置同一50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

供试品溶液：精密量取样品5 mL，用0.1 mol/mL盐酸调pH至3，涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min，过MCX柱（规格为500 mg/6 mL，上样前用甲醇、超纯水各5 mL活化），上样液，先用5 mL 0.1 mol/mL盐酸洗脱，再分别加水、甲醇各5 mL洗脱，弃去洗脱液，最后用0.5%氨化甲醇15 mL洗脱，收集洗脱液置50℃水浴下以氮气吹至近干，加0.1%甲酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）20 mL溶解，涡旋1 min，超声（功率250 W，频率40 kHz）10 min，转移至50 mL容量瓶中，用初始流动相定容，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，用初始流动相定容，经0.22μm有机滤膜滤过，即得。

阴性对照品溶液：按走川骨刺酊标准工艺，取走马胎3.6 g，川芎3.2 g，红杜仲、天南星、骨碎补、水半夏各2.6 g制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密量取2.2项下3种溶液，按拟订试验条件进样测定。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱各峰分离良好，对照品溶液及供试品溶液目标峰保留时间一致，且阴性对照无干扰。MRM色谱图见图1至图3。

线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液0.010，0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000 mL，置10 mL容量瓶中，分别加初始流动相定容，按拟订试验条件进样分析，以待测成分质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、定量离子峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程乌头碱为Y1＝10 523.1X1＋12 880.9，r1＝0.997 8（n＝7），次乌头碱为Y2＝10 970 X2＋10 392.7，r2＝0.997 4（n＝7），新乌头碱为Y3＝12 118 X3＋2 699.81，r3＝0.999 8（n＝7）。结果表明，质量浓度线性范围乌头碱为0.919 8～91.980 0 ng/mL，次乌头碱为1.048～104.800 ng/mL，新乌头碱为1.268～126.800 ng/mL。

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订试验条件连续进样6次，记录峰面积。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积的RSD分别为0.6%，1.1%和0.8%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一（批号为201703101）批样品，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h，按拟订试验条件进样测定，记录峰面积。结果乌头碱、次乌头碱和新乌头碱峰面积的RSD分别为1.2%，0.9%，1.2%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为201703101）样品，依法制备供试品溶液，共6份，按拟订试验条件进样分析，并计算含量。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量 分 别 为1.58，25.58，11.85μg/mL，RSD分 别 为3.8%，3.9%，1.8%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为201703101）样品10瓶，混匀，精密量取6份样品，各2.5 mL，再分别精密加入乌头碱对照品溶液（质量浓度为367.9μg/mL）0.015 mL，次乌头碱对照品溶液（质量浓度为419.2μg/mL）0.160 mL，新乌头碱对照品溶液（质量浓度为507.3μg/mL）0.065 mL，用0.1 mol/mL的盐酸调pH至3，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量及回收率。结果见表2。

图1 对照品溶液MRM色谱图A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.1 MRM chromatograms of reference solution

图2 供试品溶液MRM色谱图A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in test solution

图3 阴性对照品溶液MRM色谱图A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.3 MRM chromatograms of negative test solution

2.4 样品含量测定

分别精密量取各批次样品5 mL，依法制备供试品溶液，按拟订试验条件进样测定，以外标法定量离子峰面积，计算样品含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 测定方法选择

预试验中曾尝试用普通高效液相色谱法测定，但由于走川骨刺酊是以渗漉法提取制成，不同产地、不同采收时间和不同的炮制方法导致所用草乌药材的乌头类生物碱含量也不一样，并且样品中含有的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱量也较少，达不到高效液相色谱法的检出要求。具有高分离能力，高选择性、专属性强等优点的LC-MS/MS技术，能满足测定走川骨刺酊中3种乌头碱含量的条件。

3.2 样品提取方法选择

预试验中尝试样品取样量为10 mL，氮吹干后直接用流动相定容至50 mL，滤过，进样，但因出现平头峰无法测定；取样量为5 mL，氮吹干后直接用流动相定容至50 mL，再稀释50倍后，滤过，进样，平头峰消失；还尝试过40℃旋蒸蒸干、水浴锅蒸蒸干、用0.1 mol/mL盐酸调pH等3种方法提取，结果显示，直接调pH提取效果较好。

表2 加样回收试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n＝6）

表3 样品含量测定结果（μg/mL）Tab.3 Results of content determination of samples（μg/mL）

3.3 固相萃取柱选择

样品成分较复杂，需净化。在厂家提供的样品中3种乌头碱含量均较低，需对乌头类生物碱进行痕量浓缩，而乌头类生物碱属有机碱类，MCX固相萃取柱是净化和富集碱性化合物的强有力工具，特别是有机碱类，本试验中选择了MCX固相萃取柱对样品进行净化，结果达到了试验要求。固相萃取柱在中成药检验中的应用有待进一步摸索。

3.4 小结

该方法操作简便，精密度、重复性好，专属性高，结果准确，可用于同时测定走川骨刺酊中3种乌头类生物碱的含量测定。不同批次样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量存在一定差异，可能与使用的草乌药材的部位、采收时间及炮制方法的不同有关。