姜黄素固体分散体处方工艺优化及体外溶出度评价

陆 颖，徐子寒

（南京中医药大学附属张家港医院药学部，江苏 苏州215600）

姜黄素（CUR）是从姜科植物（如姜黄、莪术、郁金）根茎中提取出的一种天然酚类物质，属于二酮类化合物［1-2］，具有利胆、抗感染、抗病毒、抗氧化、抗凝血、调血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用［3-8］。但CUR的水溶性极低（仅为0.96μg/mL）［9］，且在胃肠道易发生葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）诱导的Ⅱ相代谢［10-11］，生物利用度极低，极大地限制了其开发应用。胡椒碱（PIP）是胡椒科植物胡椒和荜菝中的一种酚类活性物质［12-13］，也属水难溶性药物，25℃下溶解度仅为22.34μg/mL［14-15］。此外，PIP为肝脏和肠内UGTs抑制剂，可有效抑制药物UGTs诱导的Ⅱ相代谢。PIP可抑制CUR的UGTs代谢，两者联用，具有协同作用，可降低对脂质的摄取，解决肥胖问题［16］；有效降低大脑神经中炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及凋亡因子caspase-3水平，减少抑郁症状的发生，增强神经保护作用［17］；治疗溃疡性结肠炎疗效显著［18］；可抑制乳腺癌细胞的自我更新，且对正常细胞无毒副作用［19］，起到防癌、抗癌作用；可减轻DNA损伤和神经毒性，增强免疫作用［20］。将难溶性药物制备成固体分散体（SD）是改善药物溶解度、溶出度及生物利用度的常用方法［21-22］。本研究中选择CUR与PIP的临床常用配比（3∶1，m/m）的药物组合物，利用溶解度参数，筛选出与CUR和PIP 2种药物相容性均良好的载体；通过溶剂法，制备姜黄素固体分散体（CUR SD）；根据CUR与PIP 2种药物的溶出度，进一步优选出最佳载体及药物与载体的比例；通过差示扫描量热分析（DSC）法、X-射线粉末衍射分析（XRPD）法、傅立叶红外光谱（FTIR）法对制备的CUR SD进行表征，并测定CUR与PIP的溶解度与溶出度，以评价CUR与PIP溶解度与溶出度的改善情况。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010A HT型高效液相色谱仪、IRTracer-100型红外光谱仪（日本Shimadzu公司）；XP/XS型微量分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；D8 Advance型X-射线粉末衍射仪（德国Bruker公司）；Q2000型示差扫描量热仪（美国TA公司）；HY68/RCY-1型智能溶出试验仪（北京中西远大科技有限公司）；SNE-4500型扫描电镜（日本Hitachi公司）；MXS1100型涡旋混合仪（美国赛洛捷克公司）；KH500DE型超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

姜黄素对照品（批号为110823-201405，纯度为98.9%）、胡椒碱对照品（批号为110775-201405，纯度为98.9%），均购自中国食品药品检定研究院；姜黄素原料药（批号为BD9137，纯度＞98%，上海毕得医药科技有限公司）；胡椒碱原料药（批号为91197C，纯度＞98%，上海泰坦科技股份有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30）、聚乙烯吡咯烷酮BS630（PVP S630），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羟丙基纤维素（HPC）、羟丙基甲基纤维素（HPMC），均购自上海贤鼎生物科技有限公司；盐酸（分析纯），乙腈、甲醇（色谱纯），均购自国药集团化药试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、吐温-80、磷酸二氢钾（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 CUR SD分析方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.5%磷酸溶液（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：342 nm（PIP），425 nm（CUR）。

2.1.2 线性关系考察

取CUR对照品5.205 mg、PIP对照品5.185 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）使溶解，即得CUR对照品贮备液（质量浓度为208.2μg/mL）和PIP对照品贮备液（质量浓度为207.4μg/mL）。吸取适量上述溶液，分别逐级稀释0，2，4，8，16，32，64倍，按拟订色谱条件进样测定。分别以CUR与PIP对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果，CUR的回归方程为YC＝83 480 XC＋82 499（R2＝0.999 9），线性范围为3.25～208.20μg/mL；PIP的回归方程为YP＝67 359 XP＋62 547（R2＝0.999 9），线性范围为3.24～207.40μg/mL。

2.2 CUR SD的载体优选

2.2.1 药物与载体相容性研究

只有药物与载体间的相容性良好，才能形成性质稳定的SD。选用基团贡献法，采用Molecular Modeling Pro分子模型预测软件，计算CUR和PIP及不同载体的Hansen溶解度参数（δ），分析CUR和PIP与载体间的相容性。当药物与载体溶解度参数差（Δδ＜7 MPa1/2）时，药物和载体相容性良好；当Δδ＞10 MPa1/2时，药物与载体相容性差［23-24］。分析结果见表1，根据溶解度参数计算结果，初步筛选的载体有PVP K30，PVP S630，HPC，HPMC。

表1 姜黄素和胡椒碱及各高分子载体的溶解度参数Tab.1 Solubility parameters of CUR，PIP and other polymer carriers

2.2.2 载体筛选

根据2.2.1项下计算结果，取上述4种载体，采用溶剂法制备CUR-PIP聚合物三元固体分散体（CURPIP-PVP K30 SD，CUR-PIP-PVP S630 SD，CURPIP-HPC SD，CUR-PIP-HPMC SD）。按药物［CURPIP（3∶1，m/m）］与载体（PVP K30，PVP S630，HPC，HPMC）质量比为1∶3，加入无水乙醇，使CUR和PIP及载体溶解。通过旋转蒸发除去溶剂（45℃），真空干燥过夜，研成细粉，过60目筛，制备得不同载体的CUR SD。以不同SD中CUR和PIP的累积溶出率为考察指标，进一步优选载体。为模拟人体胃肠道生理环境，选择4种不同溶出介质［0.5%吐温-80的盐酸溶液（pH 1.2），含0.5%吐温-80的醋酸盐缓冲液（pH 4.5），含0.5%吐温-80的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和含0.5%吐温-80的水］考察CUR SD的溶出行为，介质体积为900 mL，温度为37℃，转速为50 r/min，平行操作3份，分别于5，10，15，20，30，45，60 min时取样5 mL（随即补足等温度等量的溶出介质），经0.45μm微孔滤膜滤过。按拟订色谱条件测定，计算各时间点CUR和PIP的累积溶出率，结果见图1和图2。可见，在4种不同溶出介质中，以PVP K30为载体制备的SD中CUR及PIP都在5 min时就已基本全部溶出，溶出速率明显优于用其他3种载体（PVP S630，HPC，HPMC）制备的CUR SD，故选择PVP K30为载体制备CUR SD。

图1 姜黄素与不同载体在不同溶出介质中的溶出曲线（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.1 Dissolution profile of curcumin with different polymer carriers in different dissolution medium（n＝3）

图2 胡椒碱与不同载体在不同溶出介质中的溶出曲线（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.2 Dissolution profile of piperine with different polymer carriers in different dissolution medium（n＝3）

2.3 药物与载体比例的筛选

以PVP K30为载体，采用溶剂法制备SD。选择药物［CUR-PIP（3∶1，m/m）］与载体质量比1.5∶1，1∶1.5，1∶3比例，加入无水乙醇使CUR，PIP，PVP K30溶解。旋转蒸发除去溶剂（45℃），真空干燥过夜，研成细粉，过60目筛，得到3种比例的CUR SD（1∶3，1∶1.5，1.5∶1，m/m）。考察不同比例CUR SD在上述4种溶出介质中的累积溶出率，介质体积为900 mL，温度为37℃，转速为50 r/min，平行操作3份，分别于5，10，15，20，30，45，60 min时取样5 mL（随即补足等温度等量的溶出介质），经0.45μm微孔滤膜滤过。结果见图3和图4。可见，不同比例的SD中CUR及PIP的溶出速率均比原料药快，而PVP K30比例越大，溶出速率越快。因在不同溶出介质中的药物溶出行为相似，故选择含0.5%吐温-80 pH 1.2盐酸溶液中的溶出结果进行分析。5 min时，不同比例的CUR SD中CUR的溶出速率分别为CUR原料药的6.51，4.24，2.78倍，PIP的溶出速率分别为PIP原料药的4.33，3.73，3.05倍。与CUR和PIP原料药相比，不同比例的CUR SD均有较好的溶出度，溶出速率为CUR SD（1∶3，m/m）＞CUR SD（1∶1.5，m/m）＞CUR SD（1.5∶1，m/m），故选择CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）进行下一步研究。

2.4 CUR SD的表征

2.4.1 差式扫描量热分析（DSC）法

取样品4～8 mg，置铝坩埚中。测试条件：氮气流速为50 mL/min；升温速 率为10℃/min；升温范围为25～200℃。分别对CUR原料药、PIP原料药、PVP K30、2种比例的药物（1∶3，1∶1.5，m/m）与PVP K30物理混合物及2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）进行热力学分析，结果见图5。可见，CUR与PIP原料药分别在183.1℃与129.9℃处吸热峰尖锐，该峰为CUR与PIP的熔点特征峰，表明CUR与PIP原料药以晶体形式存在。PVP K30无尖锐吸热峰，表明其以无定型形式存在；2种比例的物理混合物尽管在CUR与PIP对应的熔点处无晶体特征吸收峰，但物理混合物（1∶3，m/m）和物理混合物（1∶1.5，m/m）分别在118.0℃和120℃附近各有1个吸热峰，推测在2种比例的物理混合物中，CUR与PIP发生了低共熔；而CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）中CUR及PIP的熔点特征峰均消失，证实CUR与PIP以无定型形式分散在PVP K30中。

图3 不同比例姜黄素固体分散体中姜黄素在不同溶出介质中的溶出曲线（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.3 Dissolution profile of curcumin in CUR SD with different proportion in different dissolution medium（n＝3）

图4 不同比例姜黄素固体分散体中胡椒碱在不同溶出介质中的溶出曲线（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.4 Dissolution profile of piperine in CUR SD with different proportion in different dissolution medium（n＝3）

2.4.2 X-射线粉末衍射分析（XRPD）法

测定条件：Cu靶为40 kV，40 mA；步长为0.02°；扫描速度为2°/min；扫描范围为3°～40°（2θ）。分别对CUR原料药、PIP原料药、PVP K30、2种比例的药物（1∶3，1∶1.5，m/m）与PVP K30物理混合物及2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）进行分析，结果见图6。可见，CUR原料药在7.8°，8.7°，14.4°，15.8°，17.2°，21.0°，23.2°，23.6°，24.6°，25.5°，26.6°，28.1°处有较强的晶体衍射峰；PIP原料药在12°～30°有多个较强晶体衍射峰，表明CUR和PIP原料药以晶体形式存在；PVP K30在3°～40°间无特征衍射峰，表明PVP K30为无定型载体；药物与PVP K30的物理混合物中，尽管衍射峰强度减弱，但仍存在多个CUR及PIP原料药的衍射峰，表明简单混合不会改变药物晶型状态；CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）中，CUR和PIP的晶体衍射峰消失，表明CUR与PIP以无定型状态分散在PVP K30中，与DSC法结果相符，成功制备成无定型CUR SD。

图5 差示扫描量热分析图a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.5 DSC analysis diagram

2.4.3 傅立叶红外光谱分析（FTIR）法

分别取CUR原料药、PIP原料药、PVP K30、2种比例的药物（1∶3，1∶1.5，m/m）与PVP K30物理混合物及2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）适量，置红外光谱仪中分析，波长范围为400～4 000 cm-1，结果见图7。可知，CUR原料药的主要特征吸收峰有：3 502 cm-1处为—OH伸缩振动，1628cm-1处为C＝O伸缩振动［25］；PIP原料药在1 710 cm-1处附近有C＝O特征峰［26］；PVP K30在3 453 cm-1处有O—H伸缩振动峰，在1 662 cm-1处有C＝O伸缩振动峰；2种物理混合物中，药物及载体的特征峰仍存在，表明2种药物与PVP K30未发生相互作用；CUR SD中CUR的—OH特征峰变宽，C＝O振动峰消失，PIP在1 710 cm-1处的C＝O特征峰减弱，可能是由于药物与PVP K30间发生了分子间氢键的相互作用，氢键能通过抑制相转变和重结晶来提高SD的稳定性，稳定SD中药物的存在状态［27］。

图6 X-射线粉末衍射分析图a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.6 XRPD analysis diagram

图7 傅立叶红外光谱分析图a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.7 FTIR analysis diagram

2.4.4 扫描电镜（SEM）分析

采用SNE-4500型扫描电镜观察CUR原料药、PIP原料药及2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）的表面形貌。样品均匀撒于贴有导电胶带的样品座上，喷金5 min，用干净镊子取出，置SEM仪器内，采用3 kV的加速电压扫描其表面，并进行拍照，结果见图8。可见，CUR原料药具有明显的晶形特征，呈规则的柱状结构；PIP原料药多呈大小不一的椭球状；而2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）呈不规则块状、颗粒状，CUR的柱状特征和PIP的椭球形特征已完全消失。

图8 扫描电镜图A.CUR API B.PIP API C.CUR SD（1∶3，m/m）D.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.8 SEM photographs

2.5 溶解度测定

分别加入含0.5%吐温-80的盐酸溶液（pH 1.2）、含0.5%吐温-80的醋酸盐缓冲液（pH 4.5）、含0.5%吐温-80的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和含0.5%吐温-80的水等4种溶出介质置15 mL离心管中，分别称取过量的CUR与PIP原料药、2种比例原料药（1∶3，1∶1.5，m/m）与PVP K30物理混合物、2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m），置空气摇床中，37℃下振摇24 h，取出，平衡，取上清液2 mL，经0.45μm微孔滤膜滤过，按拟订色谱条件测定，结果见表2。在不同溶出介质中，CUR和PIP原料药的溶解度差异不大，2种比例PM中CUR和PIP的溶解度均大于原料药，表明PVP K30可能具有一定的助溶效果；与CUR和PIP原料药相比，2个CUR SD中的CUR和PIP的溶解度显著提高（P＜0.01）。如在pH 1.2缓冲液中，与原料药相比，物理混合物（1∶3，m/m）和物理混合物（1∶1.5，m/m）中CUR的溶解度提高至1.71倍和1.96倍，PIP溶解度提高至1.24倍和1.32倍，可能是PVP K30为亲水性载体，使得药物润湿性增强，增加了药物的溶解度；CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）中，CUR的 溶解度提高至4.18倍和3.92倍（P＜0.01），PIP溶解度也提高至2.13倍和1.94倍（P＜0.01），表明将PVP K30与CUR和PIP组合物共同制备成无定型CUR SD，可显著提高CUR和PIP的溶解度。

表2 不同样品中姜黄素和胡椒碱的溶解度（μg/mL，n＝3）Tab.2 Solubility of curcumin and piperine in different samples（μg/mL，n＝3）

2.6 体外溶出试验

为了考察不同样品的累积溶出率，精密称取CUR原料药、PIP原料药、2种比例物理混合物及CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m），按2015年版《中国药典（四部）》通则0931溶出度与释放度测定法进行体外溶出试验，以含0.5 %吐温-80的盐酸溶液（pH 1.2）为溶出介质，转速为50 r/min，溶出介质体积为900 mL，温度为37℃，分别于5，10，15，20，30，45，60 min时取样5 mL，并随即补足等温度等量的溶出介质，经0.45μm微孔滤膜滤过，按拟订色谱条件测定，分别记录峰面积，计算出各时间点CUR和PIP的累积溶出率。结果见图9。与CUR和PIP原料药及2种比例物理混合物相比，CUR SD中CUR和PIP的累积溶出率和溶出速率均显著提高。5 min时，CUR SD（1∶3，m/m）中CUR与PIP的累积溶出率分别达78.21%与73.32%，CURSD（1∶1.5，m/m）中CUR与PIP的溶出率分别为65.58%和54.03%；物理混合物（1∶3，m/m）中CUR与PIP的溶出率为10.31%和14.65%，物理混合物（1∶1.5，m/m）中CUR与PIP的溶出率分别为5.42%和13.95%；CUR原料药及PIP原料药累积溶出率仅为2.75%和17.64%。表明制备为CUR SD后，CUR及PIP的累积溶出率和溶出速率均显著提高，CUR SD（1∶3，m/m）累积溶出率和溶出速率优于CUR SD（1∶1.5，m/m）。

图9 溶出曲线图（n＝3）A.Curcumin B.PiperineFig.9 Dissolution profile（n＝3）

3 讨论

CUR的水溶性极低，属生物药剂学分类（BCS）Ⅳ类药物，在胃肠道发生UGTs的Ⅱ相代谢，极大限制了CUR的生物利用度。但CUR具有多种药理活性，临床应用潜力较大，亟需改善生物利用度。PIP难溶于水，生物利用度也较差，但已被证实作为药物生物利用度增强剂广泛使用，可抑制参与药物代谢的酶，减缓药物体内的代谢；诱导胃肠道膜动力学改变，促进药物快速吸收。本研究中将CUR和PIP配伍使用，通过固体分散技术，改善2种药物的溶解度及溶出速率，同时抑制CUR的体内代谢，达到改善2种药物在体内吸收的目的。此外，CUR与PIP联用，可发挥协同治疗的优势，改善药物临床应用的缺陷。

本研究中首先根据CUR和PIP与不同聚合物载体的溶解度参数进行模拟分析，选择与CUR和PIP相容性均较好的载体，通过溶剂法制备CUR SD，以溶出率为指标，最终确定PVP K30为制备CUR SD的最佳载体。进一步筛选药物与载体比例时发现，3种不同比例的聚合物固体分散体溶出速率较原料药均有增加，其中2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）的溶出速率较快，而CUR SD（1.5∶1，m/m）的溶出速率相对较差。结合溶解度测定结果，选择CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）进行下一步研究。

通过DSC和XRPD对制备的CUR SD进行表征分析，证实成功制备了CUR三元无定型SD。FTIR结果表明，药物与PVP K30间可能发生分子间氢键相互作用，使CUR和PIP分散于PVP K30的网状结构中，阻滞药物重新聚集，发生重结晶［26-27］。2种比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）在不同pH的缓冲液中饱和溶解度显著增大，体外溶出速率也有明显提高，其中CUR SD（1∶3，m/m）累积溶出度和溶出速率优于CUR SD（1∶1.5，m/m）。

综上所述，将CUR和PIP组合物与PVP K30联合制备成的CUR SD可有效改善CUR及PIP的溶出率和溶出速率，有助于提高2种难溶性药物的生物利用度，扩展其临床应用。本研究中针对CUR的理化性质及应用缺陷，有针对性地选择PIP配伍使用，共同制备成三元无定型SD，为解决其他难溶性药物的溶解度、生物利用度及联合应用的问题提供了新的思路。