姜黄素对NASH肝细胞凋亡及JNK信号通路的影响

李兵兵 季 霞 阙扬铭

嘉兴市第二医院消化内科 (浙江 嘉兴, 314000)

姜科植物姜黄是一种天然调味品和食用色素原料，其主要成分之一姜黄素是一种酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节细胞凋亡等作用，价格低廉、毒性低，已被各国学者广泛应用于肝脏疾病的相关基础和临床研究[1]。虽然多项研究表明姜黄素可延缓非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发生发展，但其机制尚不十分明确。近年来研究表明肝细胞凋亡在NASH的发生、发展过程中起着非常重要的作用[2]，姜黄素对非肿瘤细胞的抗凋亡作用已被证实，并已用于多种相关疾病的研究，但国内外关于姜黄素对NASH的抗细胞凋亡作用及机制的相关研究并不多。因此，本研究通过游离脂肪酸(FFA)诱导正常肝细胞，建立NASH的体外细胞模型，并给予姜黄素干预，探讨姜黄素对NASH肝细胞凋亡及JNK信号通路活化的影响，为该中药用于防治NASH提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器 HL-7702细胞(杭州浩克生物技术有限公司)，姜黄素(Sigma, 78246-100MG)，棕榈酸(Sigma, P0500-10G)，油酸(Sigma, O-1008-1G)，1640培养液(Biological, 10437028)，胎牛血清(GIBICO, 10437028)，0.25%Trypsin(GIBICO, 25200056)，二甲基亚砜(Sigma, D2650)、Annexin V-FITC/PI Staining Solution、细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen, 40302ES50)，JNK I抗及p-JNK Ⅰ抗(abcam)，二抗(Jackson Immuno Research)，荧光显微镜(Olympus, CKX41)，离心机(长沙东旺, TD5K-Ⅱ)，CO2培养箱(Thermo, 311)，自动化酶免分析仪(北京天石医疗用品制作所, SM-3)，流式细胞仪(BD, FACSCalibur)，Western Blot电泳仪(BIO-RAD)，Western Blot转膜仪(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人正常肝HL-7702细胞用含10%胎牛血清的1640培养液，于37℃、5% CO2的温箱中培养72 h，细胞70%～80%融合时，用不含EDTA的胰酶消化传代，更换培养液。

1.2.2 药物干预及分组处理 取对数生长期的细胞1×105/ml种植到96孔板孵育24 h后，实验分为对照组、模型组、低剂量治疗组(姜黄素10 μmol/L干预)、高剂量质量组(姜黄素20 μmol/L干预)。对照组用原培养液培养，而模型组、治疗组均用内含浓度为1.0 mmol/L的游离脂肪酸(FFA，PA∶OA=1∶2)的培养液培养，48 h后收集细胞。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化后，300 g、4℃离心5 min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，收集(1～5)×105细胞。加入100 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，取5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution加入细胞悬液中混匀，避光，室温反应10 min，加入400 μl 1×Binding Buffer混匀后于1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 Western Blot法检测各组p-JNK的表达 取出细胞，去除培养液，预冷PBS洗涤2次，IP裂解液冰上裂解细胞，后加4×loading buffer，沸水浴煮5 min，冰上冷却后把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，蛋白变性后，行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，在封闭液中室温封闭1 h，加入一抗稀释液，4℃杂交过夜，TBST洗膜5 min×3次后，再加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3次，行ECL化学发光曝光、显影。对感光胶片条带进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带 β-actin的比值代表目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 4组肝细胞的凋亡率比较 4组肝细胞的早期、晚期及总凋亡率均存在统计学差异；模型组与对照组相比，早期及总凋亡率均明显增高，而高、低剂量治疗组的早期及总凋亡率均较模型组明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图1及表1。

表1 4组肝细胞凋亡率的比较

图1 4组肝细胞凋亡的流式检测结果(Q1：机械损伤；Q2：晚期凋亡；Q3：正常；Q4：早期凋亡；总凋亡=Q4+Q2)

2.2 4组肝细胞p-JNK表达的比较 4组肝细胞的p-JNK表达存在统计学差异(F=23.62，P<0.01)，其中模型组p-JNK的表达高于对照组，低剂量治疗组低于模型组，而高剂量治疗组的p-JNK表达降低较低剂量治疗组更为明显，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图2、3。

图2 p-JNK蛋白在4组肝细胞中表达的Western blot检测结果

图3 p-JNK蛋白在4组肝细胞中相对表达量的比较(模型组 vs. 对照组，低剂量治疗组 vs. 模型组，高剂量治疗组 vs. 低剂量治疗组；均P<0.05)

3 讨论

NASH的持续存在已成为肝硬化甚至肝癌的重要因素之一，有10%～25%的NASH患者在10～20年内进展为肝硬化，甚至肝癌[3]。肝细胞凋亡在NASH的发生、发展过程中起着非常重要的作用。实验证实NASH患者肝组织活检标本的肝细胞凋亡数较单纯脂肪肝组或正常对照组显著升高，并随NASH炎症及纤维化严重程度增加而增加[4]。本实验通过1 mmol/L的FFA干预正常人肝细胞来建立NASH的体外细胞模型，结果显示模型组细胞的早期凋亡率及总凋亡率均较对照组高，再次证实了肝细胞凋亡在NASH发展中的作用。

MAPKs是存在于细胞浆内的一类具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点的蛋白激酶家族，参与细胞生长、增殖、分化等多种生理过程并能将多种信号通过磷酸化传递到细胞核中[5,6]。因此，MAPKs信号通路是细胞内重要的信号转导系统，而c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路是该系统中的信号通路之一，在多种生理、病理的程序性细胞死亡过程中起重要的调控作用[7]。目前很多研究表明JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系，且JNK信号通路是诱导肝细胞凋亡的重要信号通路，该通路在NAFLD发病中起重要作用[8-10]。过多的脂类物质、ROS及炎症介质等可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通道，该激酶可通过磷酸化而活化下游调节蛋白JNK，持续的JNK活化不仅可抑制线粒体呼吸链，增加ROS的生成，还可进一步调节凋亡相关基因的含量和比例、致使细胞色素从cyt-C释放，通过死亡受体途径和线粒体等途径介导细胞凋亡，促使NASH的发病[11]。姜黄素可抑制MAPK激酶激酶1介导的JNK活化，有效阻断核转录因子c-Jun和NF-κB等下游信号途径[12,13]。Yu等[14]体内外研究表明，姜黄素与JNK特异性阻断剂SP600125作用相似，能通过抑制上游信号丝裂原活化蛋白激酶激酶4和下游底物c-Jun的磷酸化，进而抑制JNK信号通路激活，从而产生抗细胞凋亡作用。目前已有较多国内外研究证实了姜黄素通过抑制JNK磷酸化而降低心、脑、肺、肾、血管等组织的细胞凋亡[15-17]。本研究首次将姜黄素用于FFA诱导的NASH体外细胞模型并检测肝细胞凋亡及p-JNK的表达，与既往研究结果一致[18]，姜黄素可显著降低NASH的肝细胞凋亡水平，且呈剂量相关，结果亦显示与模型组相比，各组间的p-JNK的表达差异具有统计学意义，表明了姜黄素减弱NASH的肝细胞凋亡同时，抑制了JNK的活化，且姜黄素的抗凋亡作用可能与其抑制JNK过度活化相关，具体机制需进一步研究。