miR-3122靶向CMTM5调控口腔鳞癌细胞GNM凋亡的分子机制

刘一鹏 乔永明 朱保玉 王海业 耿玉东 张月兰

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是全球常见的高度致死性癌症，这归因于其复发和转移[1]。尽管已观察到OSCC的治疗持续改善，但患者的存活率并未显著提高[2]。为了提高口腔癌患者的生存率，重要的是了解口腔肿瘤发生的分子机制。Manikandan M等[3]通过高通量测序描绘了OSCC的miRNA表达谱，发现了许多表达异常的miRNA，包括miR-29b,miR-142-3p,miR-144,miR-3122。然而，miR-3122在OSCC中的生物学功能尚不明确。基于此，本研究以口腔鳞癌细胞GNM为研究对象，旨在探讨miR-3122靶向CMTM5调控口腔鳞癌细胞GNM凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

口腔鳞癌细胞GNM购自广州一科生物科技有限公司(货号：CL-0086)。GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的siRNA、CMTM5过表达质粒、miR-3122 mimics和miR-3122 inhibitor均由天津擎科合成。CMTM5抗体购自上海群己生物科技有限公司(货号：H00116173-B01)。GAPDH抗体购自武汉市武昌区科迈实验用品经营部(货号：KF703)。Annexin V-PE凋亡检测试剂盒购自广州威佳科技有限公司(货号：C1065L)。TRIzol试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司(货号：B610409-0100)。pEZX-MT01质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心(货号：pEZX-MT01)。荧光素酶标记试剂盒购自广州一科生物科技有限公司(货号：A1001-8)。BCA蛋白定量试剂盒购自北京迈瑞达科技有限公司(货号：M052460-500T)。Lipofectamine®2000购自广州泰勒生物科技有限公司(货号：11668-019)。青链霉素混合液(100×)购自上海亿言生物科技有限公司(货号：SL6040-100ml)。第一链cDNA合成试剂盒购自北京兰博利德商贸有限公司(货号：C1802)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 口腔鳞癌细胞GNM在DMEM培养基中培养，添加10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素0.1 mg/ml，37 ℃，100%空气。GNM细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板，用于转染。使用Lipofectamine®2000进行GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的siRNA、CMTM5过表达质粒、miR-3122 mimics和miR-3122 inhibitor的转染。转染后48 h进行下游实验。

1.2.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR 纳入2018年6月至2020年6月我院收治的口腔鳞癌患者60例，收集此60例患者的口腔鳞癌组织和癌旁组织。采用qRT-PCR检测基因表达。使用TRIzol试剂提取组织或细胞的总RNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒根据生产协议进行逆转录。在ABI 7500系统上进行qRT-PCR，条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s(40次循环);60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s。以GAPDH为内参对照，计算基因的相对表达量。每个样本检测3次。

1.2.3 免疫印迹 收集细胞裂解液后，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。等数量的蛋白用10% sds-聚丙烯酰胺凝胶分离电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，以抗GINS2抗体为一抗，抗GAPDH抗体为内参，4 ℃孵育过夜。随后，膜与适当的二抗孵育在室温下1 h。用化学发光基质试剂盒对信号进行成像，用凝胶成像系统检测。Western blotting实验进行了3个重复。

1.2.4 荧光素酶报告实验 荧光素酶报告质粒pEZX-MT01包含CMTM5的野生型或突变型3'UTR。使用荧光素酶报告基因系统分析荧光素酶活性前，将miR-3122 mimic或阴性对照(NC)和荧光素酶报告基因共转染至口腔鳞癌细胞GNM。

1.2.5 细胞凋亡水平的检测 根据制造商的说明，使用Annexin V-PE凋亡检测试剂盒对不同处理的细胞进行凋亡分析。简而言之，经过不同处理后，收集在6孔板上生长的漂浮口腔鳞癌细胞GNM和胰蛋白酶分离的细胞，并用冷的1×PBS洗涤。然后将细胞沉淀物用结合缓冲液重悬，并根据试剂盒方案用Annexin-V染色。荧光显微镜观察。将实验组中凋亡细胞的百分比与对照转染组进行比较。所有样品一式三份测量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-3122在口腔鳞癌组织和癌旁组织中的表达

收集60例口腔鳞癌组织和癌旁组织后，通过RNA抽取和实时荧光定量PCR发现，miR-3122在癌旁组织中的表达水平高于口腔鳞癌组织(P<0.05)，见图1。

图1 miR-3122在口腔鳞癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 miR-3122促进口腔鳞癌细胞GNM的凋亡

使用miR-3122 mimics过表达miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，而使用miR-3122 inhibitor敲低miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平下降(P<0.05)，见图2。

图2 miR-3122对口腔鳞癌细胞GNM凋亡的影响

2.3 miR-3122靶向CMTM5的3端非编码区

TargetScan、miRcode、miRDB在线分析发现miR-3122分别潜在靶向69、82、184个基因，通过取三者交集发现miR-3122共同潜在靶向22个基因，见图3A。使用miR-3122 mimics过表达miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM中GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的表达水平下降(P<0.05)，见图3B。使用siRNA敲低口腔鳞癌细胞GNM中上述基因后，发现敲低CMTM5后口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，见图3C。通过荧光素酶报告实验发现miR-3122靶向CMTM5的3端非编码区(P<0.05)，见图4A。同时，过表达miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均下降(P<0.05)，而敲低miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均上升(P<0.05)，见图4B,图4C和图4D。

2.4 miR-3122靶向CMTM5调控口腔鳞癌细胞GNM凋亡

同时敲低miR-3122和CMTM5时，口腔鳞癌细胞GNM凋亡水平无显著变化(P<0.05)，见图5A；同时过表达miR-3122和CMTM5时，口腔鳞癌细胞GNM凋亡水平无显著变化(P<0.05)，见图5B。

3 讨论

口腔癌的肿瘤分布广泛，包括嘴唇、硬腭、上、下牙槽嵴、舌前三分之二、舌下、颊黏膜、臼齿后三角区和口底[4]。2012年，OSCC在全世界造成14.5万人死亡[5]。OSCC的发展阻碍了多模式治疗的成功，导致预后不良和5年生存率低[6]。因此，研究OSCC的发生发展的分子机制对治疗OSCC是必不可少的。

在本研究中，miR-3122在癌旁组织中的表达水平高于口腔鳞癌组织(P<0.05)。过表达miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，而敲低miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平下降(P<0.05)。提示miR-3122是一个潜在的抑制肿瘤发生发展的分子。

MicroRNAs(miRNAs)是一种短(19-25nt)单链非编码RNA，通常与目标mRNA的3端非编码区中的互补序列结合，并通过随后招募RNA诱导的沉默复合物来抑制其翻译[7]。由于大于30%的人类基因被预测受到miRNAs的调控，这些miRNA控制着所有的细胞的生理和发育过程[8]。TargetScan,miRcode,miRDB在线分析发现miR-3122分别潜在靶向69,82,184个基因，三者交集为22个基因。过表达miR-3122后，口腔鳞癌细胞GNM中GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的表达水平下降(P<0.05)。敲低上述基因后，敲低CMTM5后口腔鳞癌细胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)。尽管敲低除CMTM5外的其他基因并不能引起口腔鳞癌细胞GNM凋亡水平的改变，但是这些基因在OSCC发生发展中的生物学功能值得进一步探索。此外，miR-3122靶向CMTM5的3端非编码区(P<0.05)。过表达miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均下降(P<0.05)，而敲低miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均上升(P<0.05)。因此miR-3122通过靶向CMTM5的3端非编码区来抑制其翻译。

注：*P<0.05。

注：*P<0.05。

先前的研究表明，CMTM5通过启动子甲基化作用在许多肿瘤中发挥抑癌功能，并频繁发生表观遗传失活[9]。CMTM5位于14q11.2，这是一个包含与多种癌相关的多个基因的基因座[10]。研究表明，染色体14q11.2上的基因异常会导致各种癌症的产生或生长，例如鼻咽癌，白血病，胶质母细胞瘤，脑膜瘤和口腔鳞癌[11-12]。这些结果表明CMTM5在致癌作用中具有重要作用。本研究同时敲低miR-3122和CMTM5时，口腔鳞癌细胞GNM凋亡水平无显著变化(P<0.05)；同时过表达miR-3122和CMTM5时，口腔鳞癌细胞GNM凋亡水平无显著变化(P<0.05)。因此，可以通过体外合成miR-3122 mimics，再通过合适的呈递方式将miR-3122 mimics运送到口腔鳞癌组织中可能起到缓解或治疗OSCC的效果。

注：*P<0.05。

综上所述，miR-3122通过靶向CMTM5 mRNA的3端非编码区后，降解了CMTM5的mRNA并降低了CMTM5的蛋白水平，随后促进了口腔鳞癌细胞GNM的凋亡。