miR-192在胶质瘤U251细胞中的表达及对其增殖、迁移及凋亡能力的影响

刘明亮 郑卫华 丁新生

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，起源于神经胶质细胞，其发病机制尚未明确[1]。胶质瘤的治疗以手术治疗为主，结合放疗、化疗等综合治疗，但病死率仍较高，仅次于肺癌和胰腺癌[2]。胶质瘤早期症状不明显，确诊时大多已是中晚期，治疗效果较差，严重影响患者的生存时间[3]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是1类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过多种信号途径抑制或促进肿瘤的发生发展[4-5]。研究发现，miR-192可细胞周期阻滞于于G1/G2期，在结肠癌、子宫内膜癌等癌组织中表达下调，被认为是1种肿瘤抑制性miRNA[6]。miR-192在胶质瘤中的表达及对其发生发展的影响尚未见报道。因此本研究通过分析miR-192对胶质瘤U251细胞生物学行为的影响，旨在为胶质瘤的发生机制和诊疗提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质瘤细胞株U251、LN18、U373 和正常人脑胶质细胞株HEB均来自中科院上海细胞库。RPMI-1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清FBS及胰蛋白酶(HyClone公司)；逆转录试剂盒(DBI公司)；转染试剂盒(Invitrogen公司)；miR-192 mimics；RT-PCR试剂盒(DBI公司)；TRIzol(Takara公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；Transwell小室(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 细胞培养选用RPMI-1640培养基，置于5%的CO2体积分数、37 ℃条件的培养箱中培养。每2～3天更换培养基，将生长状态稳定的U251细胞在6孔细胞培养板接种并培养24 h，随后按照LipofectamineTM RNAiMAX说明书进行转染，以miR-192 mimics为实验组，以miRNA negative control(miR-NC)为阴性对照组。miR-192 mimics序列：5'-CUGACCUAUGAAUUGACAGCC-3'，miR-NC序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

1.2.2 RT-PCR法检测不同细胞株中miR-192表达 采用RNA抽提试剂盒提取各细胞株中总RNA，用荧光定量检测试剂盒进行定量检测，以U6为内参，正向引物为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物为：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。miR-192正向引物为5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'，反向引物为：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。逆转录合成cDNA保存于-80 ℃冰箱中备用。扩增体系：cDNA 2 μl，Primer 1 μl，RNase H2O 7 μl，SYBR Primix Ex TaqTM 10 μl。miR-192的相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3 CCK-8检测U251细胞的增殖能力 具体实验过程依据CCK-8试剂盒说明书进行。将转染24 h的U251细胞以每孔(1～2)×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100 μl，另仅加培养基作为空白对照，两组均分别培养5天。将10 μl CCK-8加入每孔中，在37 ℃条件下培养2 h。酶标仪上450 nm测定每孔吸光度(optical density，OD)值。各组取3孔平均值作为表示细胞增殖能力的大小，并绘制增殖曲线。

1.2.4 平板克隆实验 将转染后的两组细胞以每孔200个接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 ml培养液后，将培养板置于5%体积分数CO2、37 ℃的培养箱中，培养2周。当出现肉眼可见的集落形成后，终止培养。随后移除培养液，将1 ml PBS加入，洗涤细胞，再用4%的多聚甲醛固定15 min，吉姆萨染色法染色20 min，置于空气中干燥。计数可见的克隆数。克隆形成率=(克隆形成数/接种总细胞数)×100%。

1.2.5 Transwell实验检测U251细胞的迁移能力 将600 μl RPMI 1640和10% FBS的培养基，加入24孔板，放入Transwell小室。使用0.25%胰蛋白酶消化转染24 h后的miR-192 mimics组和miR-NC组细胞，吹打成单细胞悬液。在Transwell 小室上层，以每孔200 μl 1×104个细胞接种，并对每组细胞设置3个复孔，48 h后，用PBS洗涤细胞3次。使用4%多聚甲醛固定30 min，再次应用PBS洗涤细胞，苏木精染色30 min后，流水清洗，拍照，计数。

1.2.6 流式细胞术检测U251细胞的凋亡率 转染48 h后收集消化后细胞，制成单细胞悬液，经5 min离心(1200 r/min)后，弃上清。PBS洗涤2次，500 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl FITC标记的Annexin V和10 μl 的PI。混合均匀后，在室温下孵育5 min，放入流式细胞仪检测。

1.2.7 hsa-miR-192靶基因的预测 应用miRWalk数据库(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)预测miR-192潜在靶基因，使用miRanda、Targetscan、miRWalk、Microt4和RNAhybrid 5种工具预测基因，取其交集。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-192在胶质瘤细胞和正常人脑胶质细胞中的表达

RT-PCR法检测人胶质瘤细胞株U251、LN18、U373和正常人脑胶质细胞株HEB中miR-192的表达，发现miR-192在胶质瘤细胞株U251、LN18、U373中的表达均明显低于HEB(P<0.05)。在胶质瘤细胞株U251、LN18、U373中，U251细胞中miR-192表达最低，选择U251胶质瘤细胞进一步分析。见图1。

图1 胶质瘤细胞和正常人脑胶质细胞中miR-192的表达

2.2 miR-192对U251细胞增殖的影响

CCK-8法检测转染miR-192 mimics和miR-NC细胞后1～5 d的OD值，绘制生长曲线，横坐标为时间，纵坐标为OD值。结果显示：与miR-NC组细胞相比，转染miR-192 mimics细胞的OD值在4、5 天时均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。平板克隆实验显示miR-192 mimics转染细胞的克隆形成率为(28.23±0.81)%，明显低于miR-NC细胞[(41.59±1.21)%]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 转染两组细胞后U251细胞生长曲线

注：A为miR-192 mimics组细胞；B为miR-NC组细胞；C为克隆形成率。

2.3 miR-192 mimics对U251细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示，转染miR-192 mimics的穿膜细胞数为(83.20 ±21.51)个/孔，明显少于miR-NC组[(126.33 ± 24.50)个/孔]，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

2.4 miR-192 mimics对U251细胞凋亡率的影响

两组细胞的凋亡率经流式细胞术检测，结果显示，miR-192 mimics组和miR-NC组的细胞凋亡率分别为(18.23±1.86)%和(10.43±1.40)%，miR-192 mimics组的细胞凋亡率明显高于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图4 两组细胞Transwell实验结果

注：A为miR-192 mimics组细胞；B为 miR-NC组细胞；C为两组细胞凋亡率。

2.5 miR-192靶基因预测

利用miRWalk数据库预测miR-192靶基因，并取Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和 Microt4数据库的检测结果取交集，部分靶基因详见表1。选择其中1个潜在靶基因SMC5，利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda常用数据库反向预测SMC5相互作用的miRNAs，显示miR-192与SMC5的3'UTR区以不完全互补的方式结合。因此，SMC5可作为miR-192的靶基因以进一步分析。

3 讨论

胶质瘤是颅脑内常见的恶性肿瘤，近年来其发病率及死亡率逐渐上升，即使经过手术切除治疗，由于其恶性程度较高且血供丰富，术后复发率仍较高，生存时间较短，预后较差[7]。因此，寻找可靠的标志物和行之有效的干预靶点，是对胶质瘤的复发和转移早诊断、早治疗，进而改善胶质瘤患者预后的关键。miRNA是一类内源性非编码RNA，通过结合特定mRNA 3'UTR端从而进一步调节靶基因的表达，广泛参与体内的生理过程，其在肿瘤细胞如增殖、迁移、凋亡等生理病理进展的调控作用，也越来越受到重视[8]。miR-192定位于11号染色体，在胃癌、肺癌、膀胱癌等多种肿瘤中表达下调，且与肿瘤的迁移、侵袭等过程密切相关，是肿瘤抑制性miRNA[9]。本研究通过检测miR-192在胶质瘤中的表达，并研究其对胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡的影响，生物学行为的影响，旨在为胶质瘤发生发展的分子机制和诊疗提供新的参考依据。

表1 利用miRWalk预测miR-192的部分靶基因

在肝癌HepG2细胞中，miR-192通过结合RBI mRNA 3'UTR端，负性调控RBI基因的表达，抑制肝癌中发挥重要作用[10]。细胞周期阻滞是抗肿瘤发生的重要机制，Georges等[11]通过研究发现，p53通过miR-192的激活，诱导细胞周期阻滞在G1/G2期，从而发挥抑癌作用。在结直肠癌中，miR-192过表达通过靶向细胞周期进程显着降低细胞增殖，且癌细胞增殖减少和细胞周期停滞与P53的状态有关，另外，miR-192的表达降低会影响结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(FU)的敏感性改变[12]。在膀胱癌中，过表达MiR-192的细胞在G0/G1期表现出显着增加，而在S期表现出显著下降。此外，miR-192的过表达显着诱导膀胱癌细胞凋亡，增加细胞周期蛋白p21，p27和Bax的水平，并降低细胞周期蛋白D1，Bcl-2和Mcl-1的水平[13]。因此，miR-192在多种肿瘤中发挥类似的抑癌作用[14]。本研究通过检测miR-192在胶质瘤细胞核正常人脑胶质细胞中的表达，通过转染miR-192 mimics 序列，上调miR-192的表达，并对U251细胞生物学行为进行检测，结果发现，miR-192在胶质瘤细胞中的表达水平显著低于人正常人脑胶质细胞，且经miR-192 mimics转染后，U251细胞生长受到抑制，细胞克隆率明显减少，且穿膜细胞数减少，表明miR-192在胶质瘤细胞中表达明显下降，可显著抑制胶质瘤细胞增殖和迁移。另外，经流式细胞术检测，上调miR-192表达后，U251细胞凋亡率显著提升，以上结果表明miR-192在胶质瘤中发挥抑癌作用，miR-192有可能作为治疗胶质瘤的潜在靶点。

本研究利用miRWalk数据库预测miR-192靶基因，并取Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和 Microt4数据库的检测结果交集，结果显示SMC5可作为miR-192的靶基因。染色体结构维持(structural maintenance of chromosomes，SMC)蛋白是1种序列保守的染色体ATP酶，真核生物中有SMC1-6，共六种，其中SMC5通过结合SMC6形成SMC5-SMC6复合体，参与染色体复制中期结构形成、维持等动态变化，保障DNA重组和修复等过程顺利进行，因而对细胞分裂过程中遗传物质的准确复制和分离重要功能活动起重要作用[15]。因此，miR-192可能是通过调节SMC5的表达水平，影响细胞周期过程中染色体结构维持、遗传物质的准确等过程，调控细胞周期的进程。

综上所述，miR-192能够抑制胶质瘤U251细胞的增殖、迁移并促进其凋亡，为胶质瘤的治疗提供潜在靶点。miR-192可能通过靶基因SMC5发挥其对胶质瘤的调控作用。