果糖1,6-二磷酸酯酶研究进展

李清平，张秀飞，梁 明，郭 彦，赵庆臻

(1.聊城大学 生命科学学院,山东 聊城 252059；2. 聊城市食品药品检验检测中心，山东 聊城 252000)

0 引言

葡萄糖作为细胞的主要碳源,不仅为各种细胞组分提供能量,在细胞内调节中也有着至关重要的作用。糖代谢的中心途径是糖异生和糖酵解途径,二者具有相同的中间产物,且其中大部分步骤为可逆反应,但有三个步骤是不可逆的,分别由不同的关键酶催化完成。其中,果糖-1,6-二磷酸酯酶(fructose-1,6-biphosphatase,FBPase)是糖异生途径中的关键酶之一,它催化果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-diphosphate,FDP)水解成果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)和无机磷,而果糖-6-磷酸又是各种生物合成途径中的重要前体,因此对于FBPase生理功能和代谢调控的研究具有重要的理论意义和应用价值。

1 FBPase的种类及结构与动力学特征

1.1 酵母中的FBPase

酵母是一种单细胞真菌,早在1943年就已发现酵母中的FBPase(EC 3.1.3.11)[1],这也是最早被报道的FBPase,研究证明调节该酶的活性能够实现酵母细胞在糖酵解和糖异生途径之间的切换,以保证细胞高效经济地利用能量[2]。

1.2 植物中的FBPase

植物中功能性的FBPase包括两种类型,一种为细胞质FBPase(cytosolic FBPase，cyFBPase),与酵母FBPase作用相同,是糖异生途径的关键酶,同时也被认为是蔗糖生物合成的关键酶,其表达和活性受到光照和干旱等环境因素的影响[3]。另一种类型是叶绿体FBPase(chloroplast FBPase，cpFBPase),它定位于类囊体基质中,其催化的FDP与F-6-P之间的转化是卡尔文循环及淀粉生物合成途径的组成部分,因此也是绿色植物实现其自养功能的重要一环。研究发现,硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)以及光照引起的pH和Mg2+浓度的变化能够调节cpFBPase活性[4]；而后又在草莓中分离出一种新型的叶绿体FBPase-cpFBPaseII,它不受硫氧还蛋白的激活,已被证实可补充酵母细胞中FBPase的缺失和非发酵碳源的生长缺陷,但对底物的亲和力较低[5]。无论是叶绿体FBPase还是细胞质FBPase,均不同程度地受到AMP和果糖-2,6-二磷酸的抑制。目前多种植物中的FBPase基因克隆及生化活性测定已完成,如苹果、甘蔗、坛紫菜和油茶中的胞质型FBPase[6-9]及马铃薯叶绿体FBPase[10],但它们具体的功能及调节机制还鲜有报道。

注：选取不同物种FBPase的氨基酸序列,利用邻接法构建其系统进化树。 cyFBP:细胞质FBPase; cpFBP:叶绿体FBPase;FBP1:肝型FBPase; FBP2:肌型FBPase.S.lycopersicum cyFBP:(番茄，XP_004252579.1); S.tuberosum cyFBP:(马铃薯，NP_001274842.1); V.vinifera cyFBP:(葡萄，XP_002269230.1); G.hirsutum cyFBP:(陆地棉，AGU12783.1); C.oleifera cyFBP:(油茶，QGW58450.1); S.oleracea cyFBP:(菠菜，XP_021857795.1); B.vulgaris cyFBP:(甜菜，prf||1906373A); M.domestica cyFBP:(苹果，XP_008381814.2); A.thaliana cyFBP:(拟南芥，NP_175032.1); Z.mays cyFBP:(玉米，NP_001151106.2); S.officinarum cyFBP:(甘蔗，CAA61409.1); O.sativa cyFBP:(水稻，BAA25422.1); S.cerevisiae FBP:(酿酒酵母，QHB10516.1); P.haitanensis cyFBP:(坛紫菜，AIY29189.1); H.sapiens FBP1:(人，NP_000498.2); M.musculus FBP1:(家鼠，NP_062268.1); H.sapiens FBP2:(人，EAW92616.1); M.musculus FBP2:(家鼠，NP_032020.2)；S.lycopersicum cpFBP:(番茄，NP_001315602.1); S.tuberosum cpFBP:(马铃薯，XP_006349477.1); C.oleifera cpFBP:(油茶，QGW58457.1); S.oleracea cpFBP:(菠菜，AAD10207.1); A.thaliana cpFBP:(拟南芥，CAA41154.1); V.vinifera cpFBP:(葡萄，XP_002270826.2)。

1.3 动物中的FBPase

与酵母中一样,无脊椎动物基因组中也只有一个FBPase位点[11]；而脊椎动物中的FBPase则有肝型 FBPase(FBP1) 和肌型 FBPase(FBP2)两种同工酶,其蛋白质同源性约为77%[12]。其中FBP1主要分布在肝脏和肾脏,肝脏是糖异生的主要器官,参与机体血糖水平的调节；而肾脏在长时间处于饥饿或患有糖尿病机体内也会参与糖异生的调节。FBP2主要在非糖异生的细胞中广泛表达[13],但具体功能尚不明确。

从酵母及部分动植物FBPase的系统进化树(图1)中可以看出,哺乳动物肝型FBPase(FBP1)与肌型FBPase(FBP2)在进化上均与酵母FBPase很接近,植物中胞质FBPase(cyFBP)也是与酵母FBPase同源,而叶绿体FBPase(cpFBP)在进化上与酵母FBPase的亲缘关系较远,可能是由其他如叶绿体祖先中的基因演变而来的。

1.4 FBPase的结构与动力学特征

有关FBPase蛋白质的结构及动力学特征主要是利用哺乳动物肝肾中的FBP1分析的,但基于这两种同工酶在催化位点和底物结合位点上的高度相似性,肌型和肝型FBPase的催化机制应该完全相同。该酶是同源四聚体,单亚基分子量约为37 ku。每个单体蛋白由两个结构域组成：一个含有底物结合位点,称为FBP结构域；另一个可变构的结构域可与AMP和NAD+相互作用,称为AMP结构域。AMP(可能还包括NAD+)能与AMP结构域的结合,从而将FBPase稳定在失活的“T-状态”。而二价阳离子如Mg2+、 Mn2+、 Co2+或Zn2+对于酶的催化活性是必须的,可使FBPase由无活性的“T-状态”转变为活性的“R-状态”,这些离子可能结合于底物果糖-1,6-二磷酸的1位磷酸基团上。而Ca2+则是肌型FBPase的强抑制剂,但对肝型FBPase影响很小。另外,肝型和肌型FBPase都能被某些一价阳离子(如Na+、K+和NH4+)激活,也都会受到果糖-2,6-二磷酸的抑制,因为它会与底物果糖-1,6-二磷酸竞争结合FBP结构域[14]。

我们选取不同物种中有代表性且定位于细胞质中的FBPase(分别来源于人类肝型FBPase、酵母FBPase及拟南芥胞质FBPase),利用Swiss-model构建了其三维结构模拟图,并以其中一个亚基为例将其配体位点标示(图2)。从图中可以看出,与哺乳动物FBP1的结构相似,酵母与拟南芥胞质FBPase也均为同源四聚体,这与FBPase功能的保守性是一致的。人类肝型FBPase的结构研究较为清楚,可以确定其AMP的变构位点及FBP与Mg2+的结合位点；而酵母及拟南芥胞质FBPase目前只能确定金属离子的结合位点。

注：(a) 人类肝型FBPase(NP_000498.2)；(b) 酵母FBPase(QHB10516.1)；(c) 拟南芥胞质FBPase(NP_175032.1)。图2 不同物种FBPase的三维结构模拟图

2 FBPase的生理功能及调控机理

2.1 酵母中FBPase的活性调节及降解机制

当酵母细胞生长在非发酵碳源(如乙醇)培养基上时,FBPase开始合成并启动糖异生途径,从而将无机碳转变为葡萄糖供细胞利用；一旦在培养基中添加葡萄糖,细胞中就会发生由糖异生向糖酵解途径的快速转变,以阻止ATP的无效循环水解,从而避免能量浪费。关闭糖异生途径的分子机制就是FBPase蛋白的代谢物失活和降解,主要包括其编码基因FBP1的表达抑制,FBPase蛋白的磷酸化修饰及果糖-2,6-二磷酸和AMP的变构抑制,随之而来的即是FBPase的快速降解[5]。

在酵母细胞中FBPase蛋白的降解可以有不同的方式(图3)。研究者首先发现FBPase的降解依赖于液泡,并分离了葡萄糖诱导下FBPase液泡输入及降解缺陷的vid(vacuolar import and degradation)突变体[15]。除此之外,Wolf等人提出分解代谢物降解的另一种机制,他们认为FBPase的代谢降解依赖于完整的蛋白酶体,而其降解的前提是FBPase的多聚泛素化[16]。有趣的是,FBPase的降解可以从蛋白酶体途径转移到液泡降解途径,这个过程取决于酵母细胞葡萄糖饥饿的持续时间[17]。最近还发现甲醇酵母中FBPase的降解可能与自噬途径相关[18]。

注：Fbp1是酵母果糖-1,6-二磷酸酯酶(FBPase)。Fbp1的26S蛋白酶体途径降解首先由PKA催化其磷酸化修饰,而后在特定E2(Ubc8p/Gid3p)和E3(GID Complex)的作用下多聚泛素化修饰,然后送至26S蛋白酶体降解；其液泡降解途径首先Fbp1在Vid22p、Sec28p及Vid30的参与下包裹入Vid囊泡,Vid28参与Vid囊泡的胞质定位；Vid24p则参与了FBPase由Vid囊泡向液泡的转运过程。另外Fbp1的降解可能与自噬途径有关。

2.1.1 FBPase的液泡降解途径。当酵母细胞长期处于葡萄糖饥饿状态时,FBPase会分泌到细胞周质中。当向培养基中添加葡萄糖时,FBPase会首先包裹到Vid囊泡(vacuole import and degradation vesicle)/内吞小体(endosome)中,随后通过这种中间载体被送至液泡中进行降解[19]。目前已鉴定出酵母细胞中多个参与FBPase液泡运输及降解的Vid基因,其在小鼠和人中的同源基因表明Vid基因在进化上是高度保守的。如Vid24p/Gid4p是定位于含有FBPase的囊泡的膜外周蛋白,其缺失导致FBPase在这些小泡中积累,无法被运送到液泡中降解[20]。定位于质膜的Vid22p则参与了从胞浆到Vid囊泡的转运过程[21],FBPase包裹入Vid囊泡还需要内吞途径组分SEC28的参与[22]。肌动蛋白聚合在细胞内吞的早期步骤中起着重要的作用,Vid囊泡形成的早期也需与肌动蛋白斑块结合,Vid28对于这种结合以及Vid囊泡的胞内定位起着关键作用[23]；Vid30则通过与Vid24p及Sec28p相互作用影响肌动蛋白聚合及内吞作用,从而调节FBPase的液泡降解途径[24，25]。另外,还发现TORC1(target of rapamycin complex 1)复合体的组分TOR1过表达会抑制FBPase的磷酸化及随后的液泡降解[26],但只有早期文章提及FBPase液泡降解之前需磷酸化修饰[27],但后续未见相关研究。

2.1.2 FBPase的26S蛋白酶体降解途径。当酵母细胞从非发酵培养基转移到含有葡萄糖的培养基中时,FBPase除了会通过Vid途径运送至液泡中降解,还可以通过26S蛋白酶体途径快速降解[16，28]。该途径是所有真核生物体内均具有的高度选择性的蛋白质降解途径,其中泛素化修饰是底物蛋白被送入26S蛋白酶体中降解的前提条件。泛素化修饰是通过泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme)、泛素耦合酶E2(ubiquitin conjugating enzyme)和泛素连接酶E3(ubiquitin ligase)的依次级联反应完成的[29，30]。酵母基因组中E1、E2和E3的编码基因数量分别为1、11和超过600个。E1的功能比较通用,底物蛋白的特异性主要由E3决定,而E2会影响所产生的泛素化修饰链的具体构型[31]。特定的E2-E3组合能够调控特异底物蛋白发生特定类型的泛素化修饰,从而决定该底物蛋白的命运[32]。虽然大部分底物蛋白泛素化修饰的特定E2-E3尚需解析,作用于酵母FBPase的E2和E3已经确定。Wolf 实验室鉴定了一系列的酵母Gid(Glucose induced degradation)基因,发现由Ubc8p/ Gid3p作为E2[33],由7个Gid蛋白组成的GID复合物作为泛素连接酶E3[2，34]，共同参与了FBPase的泛素化修饰。生化分析表明,GID复合物中的两个亚基Gid2和Gid9具有非经典的RING结构域,承担其E3活性[2],而Gid4则是在添加葡萄糖后才结合到由其他6个亚基组成的复合体中,组成具有E3活性的完整的GID复合体[34]。另外,还发现HSP70类分子伴侣Ssa1在快速清除糖异生酶包括FBPase的泛素蛋白降解途径中起着重要作用[35]。

2.2 FBPase对植物生长发育的影响

绿色植物通过光合作用将大气中CO2首先固定成磷酸三碳糖,而叶绿体中的磷酸三碳糖有两种去向：一是运送到细胞质中合成蔗糖,二是在叶绿体中转变成淀粉。细胞质型和叶绿体型FBPase分别是蔗糖和淀粉合成的关键酶,叶绿体FBPase同时还是卡尔文循环的关键酶,因此这两种FBPase在光合碳同化和分配过程中起重要作用。

科学家们尝试通过改变基因表达量来分析植物中这两种FBPase的功能。将胞质FBPase与磷酸三碳糖转运蛋白(triose-phosphate translocater,TPT)同时过表达的拟南芥,表现出比野生型莲座叶大、鲜重提高等生长更旺盛的表型,转基因植物中光合碳同化速率及可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量也明显提高,证明胞质型FBPase的确是蔗糖合成的关键酶[36]；但拟南芥胞质FBPase突变体与野生型并无明显差异,其体内蔗糖含量没有降低的原因可能是由叶绿体输出的己糖或己糖磷酸盐补偿了胞质中(由于cyFBPase缺失导致的)通过糖异生途径生成六碳糖的缺陷[37]；马铃薯中也有类似的结果,利用反义技术降低其胞质FBPase的活性虽然会导致蔗糖合成速率有所降低,但对马铃薯的生长发育和块茎几乎没有影响[38]。但水稻中胞质FBPase突变体的光合速率明显降低,蔗糖合成受损,出现了严重的生长迟缓现象甚至导致死亡[39],这种单双子叶植物表现出的差异还需进一步分析。

研究表明,改变叶绿体FBPase表达水平对植物的光合作用和淀粉及可溶性糖的分配都有着重要影响。利用反义RNA技术降低拟南芥叶绿体FBPase的表达量,会使植物中蔗糖含量提高,同时氮代谢也发生了改变[40]；在其基因功能完全敲除的突变体中,光合作用和CO2固定速率等许多过程都受到影响,突变体比野生型明显生长迟缓；胞质型和叶绿体型FBPase的双突变体则表现为叶绿体FBPase突变体的表型[37]。抑制番茄叶绿体FBPase活性,其果实的重量平均减少20%[41]。综合不同物种中下调cpFBPase活性的结果,可以看出叶绿体FBPase的不同表达量对光合碳同化产生不同的影响：当叶绿体FBPase的活性被抑制20%以内会促进光合作用和碳同化,而被抑制80%以上将会对植物造成伤害[42]。叶绿体FBPase的活性受f型及m型硫氧还蛋白调节[43，44],豌豆中还发现S-亚硝基化也是影响叶绿体FBPase活性的因素[45]；在拟南芥细胞质中过表达蓝藻FBPaseII,由于碳分配的改变影响了生长素和独脚金内酯等激素代谢和响应过程,进而促进了植物侧根的生长[46]。

2.3 动物中FBPase的生理功能及抑制剂研究

2.3.1 肝型FBPase是调节糖代谢的关键酶。FBPase是调节糖异生途径的关键酶,在动物内源性葡萄糖的合成、输出及调控中发挥重要作用。肝型FBPase即 FBP1主要在糖异生器官如肝脏、肾脏中表达,在葡萄糖和糖原合成中发挥重要的调节作用[14]。虽然糖异生途径的酶一般都定位于细胞质中,但肝型FBPase也发现有细胞核定位[47]。糖异生途径异常是人类 2 型糖尿病的主要原因,研究发现,在肥胖和胰岛素抵抗动物模型中,FBPase及其调节的糖异生作用均增加；在小鼠中过表达人类肝型FBPase也导致其葡萄糖水平增高[48]。因此,FBPase 成为人类糖尿病治疗的靶点之一,其抑制剂的研究成为新药研发的一个重要方向。FBPase有两种内源性生理抑制剂,一种是底物 FDP的类似物果糖-2,6-二磷酸(fructose-2,6-diphosphate),它与 FDP 竞争性地结合于 FBPase 的激活位点,抑制其活性；另一种则是与 FBPase 变构位点结合的 AMP,可使 FBPase 处于失活状态[49]。近年来,许多靶向AMP位点的FBPase抑制剂被开发,然而这些抑制剂均没有表现出合适的效力和药物性。最近,研究者发现几个硝基苯乙烯化合物共价结合在FBPase上的C128位点上,显示出对FBPase的强大抑制作用[50],起到有效的降血糖作用,但后续研究尚未报道。另外,肝型FBPase缺乏还是引起孩童复发性低血糖和酸中毒的重要原因[51]；最新证据还表明FBP1在几种癌症的肿瘤起始和进展中也发挥着关键作用[12，52]。

2.3.2 肌型FBPase的生理功能。研究表明收缩肌中糖酵解产生的乳酸有多达50%可以在肌肉中转变成糖原,而不是经血液运送到肝脏中通过糖异生途径生成葡萄糖[53],这说明肌肉中的FBP2一定是有活性的。对其机理的研究发现,肌型FBPase即FBP2能够与肌型醛缩酶ALDOA(糖酵解关键酶,催化果糖-1,6-二磷酸与磷酸三碳糖之间的相互转换)结合,它们以代谢物依赖的方式形成一个底物通道[54，55]。通过这个通道,ALDOA催化反应的产物果糖-1,6-二磷酸(FDP)可以直接转移至糖原合成途径,因此可以保护FDP,避免其被糖酵解途径降解。目前认为这是使得肌纤维能够从碳水化合物前体合成糖原的基本机制[56]。FBP2-ALDOA复合物定位于横纹肌Z-线的两侧,其稳定性受Ca2+调节。肌肉收缩时伴随着钙离子浓度的升高,刺激了FBP2从FBP2-ALDOA-Z-线复合物中解离出来,位于细胞质中游离的FBP2立即被AMP和Ca2+抑制,这就避免了细胞中由于糖异生和糖酵解同时发生而导致的能量浪费。在胰岛素促进糖酵解速率增加时也是通过相同的机制完成对糖异生的抑制[57]。近年还发现FBP2而非FBP1对线粒体的ATP合成有保护作用,这两种FBPase似乎都有抑癌作用[14]。

3 结语

FBPase是一种进化上非常保守的碳水化合物代谢途径中的关键酶,其催化的反应决定了该酶的功能在细胞代谢中的重要性。早在1943年就发现了第一个FBPase,但近一个世纪以来,对FBPase的研究大部分停留在它是糖代谢的调控因子,侧重于研究其酶促动力学及酶的蛋白结构等方面。近年来动物中FBP1除了糖异生途径关键酶的细胞质定位,还被发现其存在于细胞核中；FBP2更是在多种组织中有非常广泛的表达,包括神经元这种一般认为不会发生从碳水化合物前体合成糖原的部位。这些信息表明FBPase在细胞中的功能不仅仅是糖代谢调控这一个方面,更有可能通过多个途径参与细胞命运的调节,具有比我们现在所认识到的更加重要的生物学功能,目前这方面的研究还处在起步阶段[14]。绿色植物特有的叶绿体FBPase是卡尔文循环及淀粉合成的关键酶,它与在细胞质中参与糖异生途径的胞质FBPase都在光合碳同化和分配中起重要的调控作用,因此对植物的生长发育至关重要,但它们本身的调控机制还知之甚少。目前酵母中FBPase降解的机制研究得较为清楚,但动植物中还没有相关方面的报道,这应是今后研究FBPase作用机制的主要方向之一。