徐淮地区7个甘薯茎线虫群体的形态学及分子生物学鉴定

陈晶伟，马居奎，张成玲，杨冬静，唐伟，谢逸萍，孙厚俊

摘要：從江苏省徐淮地区7个采集地的甘薯块根中分离到7个甘薯茎线虫群体，通过形态学鉴定，其特征与已报道的腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）基本一致。利用rDNA-内转录间隔区（ITS）通用引物、腐烂茎线虫特异性引物检测，发现群体JSXZ为B（L）型，其余6个分离群体均为A（S）型腐烂茎线虫。结合ITS-5.8S-ITS2区序列分析并构建系统发育树，结果进一步表明，所获序列与腐烂茎线虫相似性最高，且各分离群体与徐淮地区已报道的相同基因型的腐烂茎线虫群体序列相似性均在99%以上。群体JSXZ没有与腐烂茎线虫A型、B型群体聚在一起，而是与C型、D型群体聚为1个分支，且和C型亲缘关系更近，所以群体JSXZ被鉴定为C型腐烂茎线虫;群体JSWJ、JSYJ、JSGS、JSHW、JSLQ和JSNG与A型腐烂茎线虫群体聚为1个分支，均为A型腐烂茎线虫，且与其他基因型区分明显。危害徐淮地区甘薯的腐烂茎线虫亲缘关系近，基因型种类多，存在A型、B型和C型，其中A型腐烂茎线虫为优势群体。

关键词：甘薯;腐烂茎线虫;鉴定;系统发育树

中图分类号：S432.4+5文献标识码：A文章编号：1000-4440（2021）06-1409-08

Morphological and molecular biology identification of seven stem nematode populations of sweet potato in Xuhuai area

CHEN Jing-wei，MA Ju-kui，ZHANG Cheng-ling，YANG Dong-jing，TANG Wei，XIE Yi-ping，SUN Hou-jun

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweet Potato of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xuzhou 221131， China）

Abstract：Seven populations of sweet potato stem nematodes were isolated from storage roots of sweet potatoes from seven regions in Xuhuai area of Jiangsu province. Characteristics of the stem nematodes were basically identical to Ditylenchus destructor reported previously through morphological identification. By detections using universal primers of rDNA- internal transcribed spacer （ITS） region and specific primers of D. destructor， it was found that population JSXZ belonged to B（L） type of D. destructor， while the other six isolated populations all belonged to A（S） type of D. destructor. The results further suggested that， the sequences of the stem nematodes shared the highest similarity with D. destructor though sequences analysis of ITS-5.8S-ITS2 region and phylogenetic tree construction， and sequence similarity of the separated populations compared with the D. destructor populations carrying the same genotype reported in Xuhuai area were all above 99%. Results of phylogenetic tree analysis showed that population JSXZ did not cluster into one branch with type A and type B populations of D. destructor， but clustered into one branch with type C and type D populations of D. destructor， and had closer affinity with type C. Therefore， JSXZ population from the sweet potato was confirmed as type C of D. destructor. Populations of JSWJ， JSYJ， JSGS， JSHW， JSLQ and JSNG were clustered into one branch with population of type A of D. destructor， which were all confirmed as type A of D. destructor and were clearly distinguished from other genotypes. It was indicated that populations of D. destructor which harmed sweet potatoes in Xuhuai area were closely related and had various genotypes， such as type A， type B and type C， among which type A was the dominant population.

Key words：sweet potato;Ditylenchus destructor;identification;phylogenetic tree

茎线虫病害严重威胁中国甘薯产业的发展，其病原物为腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor），最早在马铃薯（Solanum tuberosum）上被发现，故也称Potato nematode[1]。国内腐烂茎线虫首先发现于甘薯（Ipomoea batatas）中，主要侵染贮藏根并引起腐烂，造成糠心或糠皮等症状，危害严重时可导致减产80%以上，乃至绝收[2-3]。随后，又在马铃薯及一些中药材上发现其危害[4-5]。现已被亚太植物保护组织及许多国家和地区列为植物检疫性有害生物[6]。

线虫形态特征复杂且有相似的特点，仅依靠形态学鉴定，难以在种水平及基因型上进行区分，因此分子生物学检测已成为研究植物寄生线虫的常用手段[7]。据相关文献报道，腐烂茎线虫存在种内分化的现象，如王金成等[8]、黄健等[9]、章淑玲等[10]分析了国内不同腐烂茎线虫群体的rDNA-内转录间隔区（ITS）序列后发现，中国的腐烂茎线虫明显存在2种基因型，即A（S）型和B（L）型。宛菲等[11]根据腐烂茎线虫rDNA-ITS区分别设计了针对这2种基因型的特异性引物，并准确检测出国内6个省（市、区）的21个甘薯腐烂茎线虫群体的基因型。国外学者也深入研究了腐烂茎线虫群体分化的现象，如Subbotin等[12]对世界范围内不同寄主植物的腐烂茎线虫群体的rDNA-ITS区序列进行分析比对后发现，不同线虫群体之间ITS1-5.8S-ITS2序列长度的变异源自ITS1区存在的重复序列，且该重复序列能在RNA二级结构中形成稳定的茎环，在保留A（S）型的基础上，将B（L）型进一步细分为B～G 6种不同的基因型。Jeszke等[13]结合NCBI已发表的腐烂茎线虫rDNA-ITS区序列构建系统发育树，鉴定出波兰3个不同地区腐烂茎线虫分离种群均为C基因型。现已发现危害甘薯的腐烂茎线虫基因型有A型、B型、C型、E型和F型[10，12，14]。

甘薯对于带动区域农业农村经济发展有着举足轻重的作用，且已成为国内许多省份及地区调整农业产业结构、促进农业农村发展的重要农作物之一[15-16]。目前，甘薯茎线虫病害在中国北方薯区春作地发生严重[2]。江苏省甘薯产业总体发展态势良好，但甘薯茎线虫病害严重制约甘薯单位面积产量的提升，阻碍甘薯产业发展。本研究针对江苏省徐淮地区不同甘薯茎线虫分离群体进行形态学和分子生物学鉴定，并基于rDNA-ITS区构建系统发育树，以明确线虫危害种类及系统发育地位，为甘薯茎线虫病害的快速诊断和防控提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

2019-2020年，对江苏省徐淮地区7个线虫危害严重的薯田进行样品采集，并拍摄记录田间甘薯受害症状。采用随机采样法，将受害薯块装入聚乙烯薄膜自封袋内，并标记采集时间、地点、前茬作物及土壤类型等信息，带回实验室进一步分离与鉴定。DdSH、DdTS、DdXY、DEsg为江苏徐淮地区已报道的甘薯上的腐烂茎线虫群体[8，11]（表1）。

1.2线虫的分离与纯化

将病薯切成碎屑，利用浅盘法分离线虫[1]。获得线虫后，用0.1%青霉素+0.1%链霉素浸泡，4 ℃下放置12 h消毒，用无菌水清洗3遍后保存备用。在体式显微镜下挑取已消毒的雌虫和雄虫各50头放入茄腐镰刀菌（Fusarium solani）培养皿中进行纯化培养，保存备用。

1.3线虫的形态观察和测量

线虫的杀死、TAF固定、临时玻片制作均参照文献[17]。通过配备Leica相机（DFC550）的显微镜（Leica DM4000B）观察制作的线虫临时玻片。使用相机配套软件进行拍摄并记录各虫态形态特征图片;形态测量值利用配套软件，按照De Man公式[17]进行测量计算，即a=体长/最大体宽;b=体长/食道长度（从头到食道与肠结合处）;c=体长/尾长;V=头至阴门距离/体长×100。每个特征值，观察20个标本。

1.4线虫分子生物学鉴定

1.4.1DNA提取方法参考单条花生茎线虫（D.arachis） DNA 提取方法[18]，用ddH2O把挑到的线虫清洗干净后，转移至装有8 μl ddH2O、1 μl 10×PCR buffter的PCR管内，将PCR管在掌上离心机中快速离心后，放至液氮中浸泡约30 s，然后加1 μl蛋白酶K（1.2 mg/ml）到管内。最后，将PCR管放置于PCR仪中于65 ℃温育1.5 h，再于95 ℃放置10 min，取出放至室温即可用于PCR扩增或置于-20 ℃备用。

1.4.2PCR引物扩增试驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系为25.0 μl，其中模板DNA 2.0 μl，上游引物（10 μmol/L）1.0 μl，下游引物（10 μmol/L）1.0 μl，PCR Mix（Premix TaqTM，TaKaRa）12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。

（1）rDNA-ITS序列扩增。采用引物ITSP1/ITSP2（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′，5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）扩增[8]。反应程序：94 ℃，4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

（2）特异性引物扩增。A（S）型特异性引物为DdS1/DdS2（5′-TCGTAGATCGATGAAGAACGC-3′，5′-ATTATCTCGAGTGGGAGCGC-3′）;B（L）型特异性引物为DdL1/DdL2（5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT-3′，5′-GAGTGAGAGCGATGTCAACATTG-3′）[11]。反应程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳确定目的条带，扩增产物寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.4.3序列提交、分析及系统发育树构建依据序列提交步骤将本试验所得序列上传至GenBank，获得序列号（表1）。采用MEGA 6.0和DNAMAN软件进行多序列比对分析。采用jModelTest v.2.1.2AIC标准进行最佳匹配替代模型估算[19]，采用DAMBE v.7.0.28软件[20]进行基因替代饱和度检测。在CIPRES Science Gateway（www.phylo.org）[21]平台上进行在线序列分析。分别使用MrBayes 3.2.6 on XSEDE[22]和RAxML-HPC2 on XSEDE[23-24]进行贝叶斯法与最大似然法分析。贝叶斯系统发育树分析采用GTR+I+G模式，运算5 000 000代，每运算100代对树形进行Markov chains采样，剔除初始25%采样;最大似然法分析采用GTRCAT模型，完成1 000次自展重复。采用Figtree v1.4.3和Adobe Illustrator CC在贝叶斯50%多数原则一致树上标注自展值和后验概率。

2结果与分析

2.1甘薯茎线虫病主要症状特点

受病原线虫危害的大田中，甘薯地上部分在生长前期症状不明显，症状在中后期显现，薯蔓近地面的主蔓基部纵切后可见髓部呈黑褐色干腐样，呈糠心状，而发病严重的植株糠心可达薯蔓顶部，叶片逐步发黄，直至主蔓枯死（图1A、图1B、图1C）。薯块受害后大多表现为糠皮或糠心，丧失经济价值。糠皮型薯块表皮褪色泛青，有的还会出现凹陷或裂口，导致薯皮龟裂。纵切后可见皮下组织干腐变褐，呈圆环状（图1D、图1E）。糠心型薯块的皮层与健康薯块无差异，但是薯块质量显著下降，切开后可见薯块内呈褐白相间的干腐症状（图1F）。甘薯受害后期，发病严重时，糠皮和糠心会混合发生，并常伴随真菌、细菌和螨类等二次侵染（图1G）。

2.2甘薯茎线虫形态学鉴定

雌虫温热杀死后可见整个虫体略向腹面弯曲（图2A）。虫体侧区可见6条清晰侧线（图2C）。唇区平滑，头区稍有缢缩，口针细直，口针基部球明显，中食道球似纺锤形，瓣膜可见，排泄孔位于食道肠道连接处略靠上方，后食道腺覆盖于肠道背面（图2D）。阴门明显，侧面观可见向外突起，后阴子宫囊明显，长约占肛阴距的2/3，尾略向腹面弯曲，末端圆滑（图2F、图2G）。

雄虫温热杀死后，虫体前端较为平直，尾端向腹面弯曲度大（图2B）。交合刺发达，尾部侧面可见交合刺向腹面弯曲，交合伞由交合刺前端延伸至尾长约3/4处，尾端窄圆（图2H、图2I）。其余特征与雌虫类似。

A：受害大田;B、C：甘薯地上茎部症状;D、E：糠皮型薯块;F：糠心型薯块;G：线虫危害后期甘薯。

A：雌虫虫体;B：雄虫虫体;C：雌虫侧区;D：雌虫头部与食道;E：雄虫头部与食道;F：雌虫尾部腹面观（箭头示阴门位置）;G：雌虫尾部侧面观;H：雄虫尾部侧面观;I：雄虫尾部腹面观;标尺，A～B：200 μm，C：25 μm，D～I：50 μm。

本研究中分离纯化的甘薯线虫群体的形态测量值见表2。由表2可知，部分线虫分离群体与Thorne[25]记载的腐烂茎线虫形态测量值存在一定差异，但与Goodey[26]的记载相符。根据主要虫态的形态学特征和主要形态测量值，初步推断各甘薯线虫群体均为腐烂茎线虫。

2.3分子生物学鉴定

2.3.1甘薯茎线虫不同分离群体rDNA-ITS通用引物检测结果分别以江苏徐淮地区7个不同的甘薯茎线虫总DNA为模板，采用通用引物ITSP1/ITSP2扩增rDNA-ITS区序列，电泳结果表明，7个分离群体样本中，除JSXZ群体扩增出约1 000 bp条带外，其余皆扩增出约780 bp条带（图3），结合形态鉴定结果，推断JSXZ群体可能为B（L）型腐烂茎线虫，其余均为A（S）型腐烂茎线虫。

2.3.2A（S）型和B（L）型特异性引物扩增结果为進一步确认各分离群体基因型，针对江苏徐淮地区不同甘薯茎线虫分离群体，分别随机挑取单头成虫提取DNA，使用特异性引物DdS1/DdS2与DdL1/DdL2进行PCR扩增，除JSXZ群体扩增出485 bp条带外，其余皆为252 bp，对照组没有条带（图4），确定JSXZ群体为B（L）型腐烂茎线虫，其余群体均为A（S）型腐烂茎线虫。

2.3.3基于rDNA-ITS的系统发育树构建及序列分析对采自江苏徐淮地区甘薯茎线虫的不同分离群体进行靶标基因的测定，通过NCBI中BLAST进行比对，发现本研究所有群体与GenBank中江苏省内腐烂茎线虫群体序列相似性在99%～100%，获取序列后上传至GenBank，获得序列登录号，详细信息见表1。依据比对结果筛选数据库中17条不同基因型的腐烂茎线虫序列，2条起绒草茎线虫（D. dipsaci）序列，加上本试验获得的7条序列，共26条序列，基于ITS1-5.8S-ITS2基因，采用贝叶斯和最大似然法构建系统发育树。结果（图5）表明所有D. destructor群体聚为一支，与2条D. dipsaci序列区分明显。JSYJ（MW648334）、JSWJ（MW648340）、JSGS（MW648337）、JSHW（MW648338）、JSLQ（MW648339）和JSNG群体（MW648336）与已知A型腐烂茎线虫群体聚为一支，表明该6个群体均为A型腐烂茎线虫，与分子鉴定结果一致。其中，JSYJ群体与DdXY群体聚为一支，表明两者遗传距离较近。

JSXZ群体（MW648335）与A型、B型群体未聚在一起，而是与已知的C型群体（EF208210、EF062574、KX181650）和D型群体（EF208213）聚为一支。通过DNAMAN软件进行序列比对分析，JSXZ群体与已知的C型群体（EF208210、EF062574、KX181650）相似性均达99%以上，其中与宿迁市C型甘薯群体EF208210的序列在ITS1区第193 bp处有1个碱基替换。与C型马铃薯群体EF062574在ITS1区41 bp和363 bp处各有1个碱基替换，与C型马铃薯群体KX181650在ITS1区96 bp、126 bp、203 bp、215 bp和227 bp处各存在1个碱基替换。而与D型群体（EF208213）同源性仅为96%，在ITS区共存在29个碱基差异，分别在ITS1区存在2个碱基缺失、2个碱基插入以及25个碱基的替换。因此，JSXZ群体与3个C型群体亲缘性更近，确定其为C型腐烂茎线虫。

M：DL2000 DNA Marker;1～3：JSWJ群体;4～6：JSLQ群体;7～9：JSYJ群体;10～12：JSXZ群体;13～15：JSNG群体;16～18：JSGS群体;19～21：JSHW群体;22：清水对照。JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ见表1。

M：DL2000 DNA Marker;1～3：JSWJ群体;4～6：JSLQ群体;7～9：JSYJ群体;10～12：JSXZ群体;13～15：JSNG群体;16～18：JSGS群体;19～21：JSHW群体;22：清水对照。JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ见表1。

JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ见表1。分支支持率：BI的后验概率估值/ML分析的自展值;拓扑结构不支持的自展值未标出。

3讨论

本研究应用形态学结合分子生物学手段对江苏徐淮地区主要甘薯产区的病原线虫进行了鉴定，对采集的7个甘薯线虫群体进行形态学观测，其形态特征均与张绍升等[27]对腐烂茎线虫的描述一致。部分群体测量值与Thorne[25]的原定种（正模）的参考值存在一定差异。对此，Goodey[26]、Wu等[28]认为这可能是由于寄主的变化，使得线虫的各测量值发生一定程度的变化，并定出比原定种（正模）测量数据范围更广的变异范围，本研究所有测量数据均在此变异范围内。鉴于寄主或不同地理因素差异会导致线虫形态数据的变异，应注意每个测量值的观测线虫数目不应过少。

目前，诸多研究结果已表明腐烂茎线虫具有明显的种内分化现象，如Jones等[29]认为腐烂茎线虫存在寄主专化小种;王金成等[8]对8个腐烂茎线虫种群ITS区序列进行分析，发现中国腐烂茎线虫的7个地理种群可明显分为A、B 2个分支，A分支种群在ITS1区有188 bp片段的缺失，并推测腐烂茎线虫在中国很可能是1个至少由2种线虫组成的复合种。章淑玲等[10]设计引物对甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区进行分析比对，发现中国的腐烂茎线虫群体的ITS1区序列分化为短型（S）和长型（L）2种基因型。宛菲等[11]设计并筛选出A（S）型、B（L）型腐烂茎线虫的2对特异性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2，对甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区进行分析比对，将宿迁市甘薯茎线虫群体（DdSH）和徐州市铜山区甘薯茎线虫群体（DdTS）鉴定为B（L）型腐烂茎线虫。Subbotin等[12]基于腐烂茎线虫ITS1区中重复序列在RNA二级结构的差异，并结合rDNA-ITS系统发育关系，在前人研究基础上将腐烂茎线虫划分为A～G 7个基因型，并发现腐烂茎线虫A（S）型特异性引物只能检测出A基因型，B（L）型特异性引物可检测出除A基因型之外的所有基因型，并将群体DdSH鉴定为腐烂茎线虫C型群体，群体DdTS鉴定为腐烂茎线虫B型群体。在本研究中，利用ITS通用引物和特异性引物对徐淮地区7个不同的分离种群进行分子鉴定，结果表明JSXZ群体为B（L）型腐烂茎线虫群体，其余6个均为A（S）型腐烂茎线虫群体，且各分离群体与徐淮地区已报道的相同基因型甘薯腐烂茎线虫序列相似性均在99%以上。JSXZ群体与C型DdSH群体序列EF208210几乎一致，仅在ITS1区有1个碱基替换。系统发育树分析结果进一步表明，6个A型腐烂茎线虫群体与已知A型群体单独聚为一支，JSXZ群体与DdSH群体及其他2个C型群体（EF062574、KX181650）聚为一支，最终将群体JSXZ鉴定为C型腐烂茎线虫。现已发现危害甘薯的腐烂茎线虫基因型有A型、B型、C型、E型和F型[10，12，14]，本研究结果及文献报道表明危害徐淮地区甘薯的腐烂茎线虫基因型种类较丰富，存在A～C 3种基因型，A型为优势种群。这与于海英等[30]調查发现国内危害甘薯的腐烂茎线虫中A型群体占大多数且分布广泛的结果一致。而就目前的发现来看，A型腐烂茎线虫仅在中国出现，且只危害甘薯，这表明中国腐烂茎线虫可能存在寄主专化性。

腐烂茎线虫不同地区群体的差异明显，说明其正处于快速进化过程中，且不同地理来源的线虫种群在形态特征[9]、致病力[31]、对乙酰胆碱酯酶抑制剂的敏感性[32]和抗药性[33]等方面存在一定差异。徐振等[34]的研究结果表明甘薯腐烂茎线虫在南方薯区存在较大的定殖风险。江苏省内甘薯腐烂茎线虫群体是否还存在其他不同基因型，各基因型腐烂茎线虫生态适应性、寄主范围、生物学特性等是否有差异，还需进一步调查研究。

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2021-04-07

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-10-B15）;徐州市农业科学院基金项目（RC2019002）

作者简介：陈晶伟（1993-）， 男， 陕西汉中人，硕士，研究实习员，从事甘薯病虫害防治研究。（Email）ibcjw0825@126.com

通讯作者：孙厚俊，（Email）sunhouj1980@163.com