MicroRNA-193a 通过靶向 WT1抑制肝细胞癌发生的机制研究

刘亚琪,郑承红

(1.湖北省襄阳市中医医院肿瘤科，湖北 襄阳 441000 2.湖北省武汉市中医医院,湖北 武汉 430065)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是仅次于胃癌和食道恶性肿瘤的第三大恶性肿瘤，男性发生率高于女性，约为 3∶1 。我国 HCC 患者年龄在 45～65 岁之间，但近年来年轻患者的发病率显著增加[1]。HCC治疗方式主要为手术，放射和化疗，且预后与临床和病理类型相关。HCC早期症状不明显，且多数患者由于晚期癌细胞分化率低，治愈率仍然较低[1]。因此，开发生物标志物用于肝癌的早期发现，诊断和治疗是当务之急。近年来，研究发现微小RNA(microRNA, miRNA)通过影响靶基因的表达可在癌症的发展中产生重要调控作用。研究表明miR-193a 在多种人类癌症中发挥抗癌作用，可以通过调节癌细胞的生长来抑制肿瘤的发展[2]。此外，miR-193a抑制乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭[3]。但是到目前为止，miR-193a在HCC中的具体作用尚不清楚。已发现在卵巢癌中，Wilms'肿瘤1(WT1)具有诊断和预后作用，且WT1的高表达与卵巢癌的侵袭性临床特征有关[4]。此外，在人乳腺癌中和类胶质瘤中证实WT1的异常表达[5,6]。但是，尚未在HCC中研究miR-193a与WT1之间的相互作用。因此本研究拟探讨，MicroRNA-193a通过靶向WT1抑制肝细胞癌的发生及对其机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1临床组织标本和患者基本资料:实验组织取自武汉市中医医院的75名HCC接受手术的患者。收集患者年龄、性别、肿瘤分期、是否转移、分化程度等资料。所有HCC患者在手术前均未接受任何治疗，术中收集肝癌组织和癌旁非癌的正常组织，并将它们冷冻在液氮中，然后保存在-80℃的冰箱中进行后续实验。所有参加本研究的患者均签署了知情同意书，该研究获得我院伦理委员会的批准。

1.2细胞培养和miR-193a mimic以及inhibitor转染:正常人肝细胞系 LO2和肝癌细胞系 MH-CC97H，HCCLM3， Huh7 HCC 细胞系购自中科院上海细胞库。将细胞系接种在含10%胎牛血清的 Dulbeco改良 eagle’s 培养基中(Gibco，美国)，于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。从RiboBio公司(广州，中国)获得miR-193a mimic或inhibitor，以及它们的对照组(NC)。 根据试剂盒说明， 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen, 美国)将它们分别转移到 HCCLM3 细胞中。

1.3实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR):根据试剂盒说明，使用TRIzol试剂(Promega，美国)提取肝癌组织总RNA，并使用cDNA合成试剂盒(TIANGEN，中国)合成cDNA。应用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美国)以及ABI 7300 序列检测系统( Thermo Fisher Scientific，美国)上进行 qRT-PCR。以U6 和GAPDH分别用作 miR-193a 和WT1 的内参对照。使用 2-ΔΔct方法计算CT值。qRT-PCR引物的设计如下：miR-193a,正向：5′-TGGGTCTTTGCGGGCGAGATGA-3′,反向ACCCAGAAACGCCCGCTCTACT-3′；U6,正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向：5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'； WT1，正向：5'-CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3'，反向：5'-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3'；GAPDH， 正向：5'-TGCACCACCAACTGC TTAGC-3'，反向：5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。

1.4细胞计数(CCK-8)试验:采用CCK-8试剂盒测定miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor转染后细胞增殖能力的变化。将 3×104HCCLM3 细胞铺板在96孔板中并孵育0、24、48和72h。然后将细胞放置在带5%CO2，37℃的保温箱。取10 μLCCK-8试剂(Dojindo Molecular Technologies，日本)添加到每个孔中处理 2h，使用酶标仪在 450 nm 的吸光度下检测。

1.5异种移植肿瘤形成试验:裸鼠(6周)购自南京大学(中国南京)的模型动物研究中心。所有动物实验均经我院动物护理和使用委员会批准，并根据《实验动物的护理和使用指南》进行。将带有miR-193a质粒或阴性对照的4×106HCCLM3细胞将其注射到裸鼠的左上侧，每4天观察一次肿瘤体积。4周后处死小鼠对肿瘤进行称重。

1.6双荧光素酶报告基因检测:将野生的或突变的WT1的3'-UTR插入pmirGLO荧光素酶载体(Promega，美国)，用于荧光素酶报告基因测定。之后，将具有WT1的3'-UTR和miR-193a模拟物的载体转染到HCCLM3细胞中。最后，使用双重荧光素酶测定系统(Promega，美国)来检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1miR-193a在肝癌组织中表达下降:与相邻的非癌组织相比，HCC组织中的miR-193a表达降低(图1A)(P<0.01)，且WT1 mRNA在HCC组织中显著高于正常组织(图1B)(P<0.01)，进一步相关性分析发现肝癌组织中miR-193a与WT1 mRNA呈显著负相关(r=-0.454,P<0.001)(图1C)。此外，miR-193a表达异常与淋巴结转移(P=0.013)和TNM分期(P=0.004)有关(表1)，提示miR-193a的异常表达可能与肝癌的发生有关。miR-193a和WT1的异常表达还与HCC患者的预后相关，高表达的miR-193a在HCC患者中具有更长的总生存期(P=0.029，图1D)。

图1 A.HCC组织和非癌组织miR-193a表达量 B.HCC组织和非癌组织中WT1 mRNA表达量比较 (**P<0.01) C.HCC组织中miR-193a 表达量与WT1 mRNA表达量的相关性 D.miR-193高表达和低表达患者HCC生存曲线分析

表1 miR-193a表达与HCC患者临床病理特征之间的关系

2.2miR-193a mimic和inhibitor对HCC增殖的影响:我们继续检测了 MHCC97H，HCCLM3，Huh7 和 LO2细胞系中 miR-193a的 表达，发现与 LO2细胞相比，MHCC97H，HCCLM3 和 Huh7 细胞系中的 miR-193a 表达下调(图 2A)。之后，将 miR-193a mimic或inhibitor转染到HCCLM3 细胞中。结果表明，miR-193a 表达通过其mimic增强， 并通过inhibitor降低(图2B)。之后我们发现 miR-193a mimic抑制了HCCLM3 细胞的细胞增殖(图 2C)(*P<0.01)。相反miR-193a inhibitor促进了HCCLM3细胞中的细胞增殖(图2D)(*P<0.01)。

图2 A.miR-193a表达量在正常肝细胞系(LO2)以及肝癌细胞系MHCC97H，HCCLM3，Huh7中的表达(**P<0.01 vs LO2 ;*P<0.05 vs LO2) B.miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor 对miR-193a 的影响 C.miR-193a mimic对 HCCLM3细胞增殖的影响 (**P<0.01 vs NC) D. miR-193a inhibitor对 HCCLM3细胞增殖的影响(**P<0.01 vs NC)

2.3miR-193过表达抑制了裸鼠成瘤:我们将miR-193a转染质粒或miR-NC注射到裸鼠中，在第4周发现注射miR-193a质粒的裸鼠中HCC的肿瘤质量显著小于miR-NC(*P<0.05)(图3A,B)。

2.4HCC中的miR-193a 直接靶向 WT1:此外，TargetScan (http://www.targetscan.org/) 数据库表明 miR-193a 具有与 WT1 的 3'-UTR 的结合位点(图 4A)。在荧光素酶报告基因实验中发现，miR-193a mimic降低了野生型WT1 的萤光素酶活性。但在具有 mut-WT1 和 miR-193a 模拟物的HC-CLM3 细胞中未观察到荧光素酶活性的降低(图 4B)，表明 miR-193a可直接靶向 WT1，并在 HCC 中对其表达起负调控作用。

图3 A.miR-193a与miR-NC注射成瘤的大体情况B.miR-193a与miR-NC注射致成瘤重量的比较(*P>0.05)

图4 A. miR-193a 具有与 WT1 的 3'-UTR 的预测结合位点 B. miR-193a模拟物降低了野生型WT1 的萤光素酶活性，但未降低WT1 Mut的活性

3 讨 论

研究表明miRNA 在HCC中具有重要的分子功能和病理学意义。目前已经发现许多癌基因和抑癌基因的 miRNA 与 HCC 的肿瘤发生有关。例如，miR-199 通过下调 HCC中 G 蛋白信号传导 17 的调节因子而起抑制性 miRNA 的作用[7]。相反，miR-219-5p通过调节钙黏着蛋白1促进了肿瘤的生长和细胞转移。本研究探讨了miR-193a与HCC之间的关系。在HCC中发现miR-193a的下调与淋巴结转移和TNM分期有关。此外，miR-193a的低表达预示了HCC患者的不良预后。在功能上，miR-193a的过表达在抑制了HCC细胞增殖。

目前已发现miR-193a在人类癌症中异常表达，并可以作为对抗癌症的重要武器[2]。例如在肺癌中检测到miR-193a的下调，还发现miR-193a的下调与非小细胞肺癌的临床病理特征及预后不良有关[8]。此外，miR-193a通过抑制CCND1表达抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭[9]。此外，miR-193a还被发现是抑制结肠癌发生的关键基因[10]。本研究中我们发现miR-193a直接靶向WT1，并在HCC中对其表达起负调控作用。WT1是促红细胞生成素基因的转录激活因子，可影响细胞生长[11]。WT1在某些人类癌症中的作用不同。此研究中，WT1起到对HCC起到了致癌作用。在HCC中发现了WT1的上调，并预示了肝癌患者的预后不良。此外，发现miR-193a通过靶向WT1抑制乳腺癌的发生[3]。近年来发现WT1被确定为几个miRNA的直接下游目标。例如，发现miR-15a和miR-16-1通过靶向白血病细胞中的WT1来抑制细胞增殖[12]。miR-590通过调节WT1表达抑制肾母细胞瘤细胞的增殖[12]。

总之，本研究结果表明miR-193a肝癌组织中的表达显著低于相邻的非癌正常组织，并与HCC患者的预后不良有关。此外，miR-193a 通过靶向 WT1来抑制 HCC 的肿瘤发生，这将有助于为HCC的诊断和治疗提供新的方向。