穿龙薯蓣皂苷元对CIA小鼠脾脏Treg细胞的影响

梁秀军，代俊利，李 强，郭亚春，高亚贤，宋鸿儒

(1.承德医学院，河北 承 德 067000 2.河北省承德市中心医院，河北 承 德 067000 3.河北北方学院，河北 张家口 075000)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种具有持续性并反复发作的自身免疫性疾病，病变以滑膜炎为主，后期可造成关节软骨和骨的破坏。RA的具体发病机制目前尚未阐明，近年来研究发现Treg细胞在RA中发挥着重要作用[1]。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是近年来新发现的一组T细胞亚群，其功能主要为负向免疫调节，可以抑制免疫细胞对抗原的呈递功能、减少细胞炎性因子的产生和抗体的分泌，对自身免疫病有抑制作用，对于维持免疫内环境的平衡起到重要作用[2]。Treg细胞特异性表达叉头样转录因子p3(foxhead box protein 3, Foxp3)，Treg细胞发挥抗炎、抑制效应细胞的过度反应和维持免疫耐受的负向免疫调节作用，主要是通过细胞相互直接接触性抑制和抑制性细胞因子的分泌(如IL-10、TGF-β)[3]。本课题组前期的研究发现穿龙薯蓣皂苷元可以抑制胶原性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)鼠关节炎症及滑膜血管新生，对RA发挥治疗作用[4]。本研究通过观察磁珠分选后的CIA小鼠脾脏中Treg细胞比例、Foxp3和IL-10的水平变化，初步探讨穿龙薯蓣皂苷元对Treg细胞的影响及可能机制，为寻找穿龙薯蓣皂苷治疗类风湿关节炎的新靶点及穿龙薯蓣的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物：30只雄性DBA1/J小鼠，SPF级，7～8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码：SCXK(沪) 2012-0002。

1.2主要试剂与仪器：Chicken type Ⅱcollagen(Chondrex公司，美国)；Freund’s completed adjuvant(SIGMA公司，美国)；CD4+CD25+Treg cell 分选试剂盒(Miltenyi Biotec公司，德国)；CD3/CD28 MACSiBead(Miltenyi Biotec公司，德国)；rIL-2(Peprotech公司，美国)；小鼠Treg细胞染色试剂盒(Ebioscience公司，美国)；SYBR Premix Ex TaqTM II 试剂盒、Foxp3引物、GAPDH引物(中国大连宝生物工程有限公司)：Foxp3-F：5'-AGTGCCTGTCCTCAATGGTC-3'、Foxp3-R：5'-AGGGCCAGCATAGGCAAG-3'；GAPDH-F：5'-AGGTCGGTGAACGGATTTG-3'、GAPDH-R：5'-TGTAGACCATGTAGGAGTTTG-3'；mouse IL-10 ELISA kit(武汉华美生物工程有限公司，中国)；穿龙薯蓣皂苷元(南京泽朗医药科技有限公司，中国)；FACS Calibur 流式细胞仪(BD公司，美国)；荧光定量 PCR 仪(上海宏石公司，中国)；全自动酶标仪(伯腾仪器有限公司，美国)。

1.3CIA小鼠模型建立：将鸡Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ, CⅡ)溶于0.05moL/L的冰醋酸中，在冰浴下搅拌使之充分溶解，质量浓度为2g/L，然后与弗氏完全佐剂(FCA)等体积混合、乳化，以乳剂在水中不分散为标准，制成CⅡ乳剂。无菌条件下在小鼠背部、尾根部皮内多点注射该乳剂，0.1mL/只。第21天，再加强注射一次，0.1mL/只。用关节炎指数(Arthritis index, AI)为标准判断模型是否成功[5]。认定AI值≥4分的小鼠为造模成功，将AI值<4分的小鼠从实验中剔除。

1.4制备CIA小鼠脾细胞悬液：CIA模型小鼠脾脏在无菌条件下被切取，超净工作台下置于培养皿中(含有RPMI-1640培养液)。用400目钢网包裹后，用无齿弯镊轻轻挤压脾脏，直至无脾组织块。用移液管吸取滤液后，再次过400目钢网收集滤液。裂红液裂解红细胞后，300g离心，10min，再用PBS洗涤2次，调整至实验所需的细胞数。

1.5免疫磁珠分离法(MACS)分选Treg细胞：取上述脾淋巴细胞悬液，用CD4+CD25+Biotin-Antibody标记脾脏淋巴细胞，4℃孵育10 min。加Anti-Biotin磁珠和CD25-PE Antibody混匀，避光15min。加Buffer离心后重悬细胞，过LD分离柱，分离得到CD4+T细胞。用Buffer重悬CD4+T细胞，加Anti-PE混匀，4℃避光15min。加Buffer离心后重悬细胞，过MS分离柱，分选得到CIA小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+Treg细胞。

1.6流式细胞术检测Treg细胞的纯度：取Treg细胞严格按照小鼠Treg细胞染色试剂盒说明书对其进行染色，采用流式细胞术检测MACS法获得的Treg细胞的纯度。

1.7Treg细胞体外培养：96孔板中种Treg细胞(1×105个/孔)，各孔培养基中加入CD3/CD28 MACSiBead(3×105个)和rIL-2(2000U/mL)体外培养。

1.8流式细胞术检测Treg细胞比例：将CIA小鼠Treg细胞分别分为穿龙薯蓣皂苷元高(25μmoL/L)、中(12.5μmoL/L)、低(6.25μmoL/L)剂量组[5]和空白对照组四组。培养48h后，收集各组细胞。按照小鼠Treg细胞染色试剂盒说明书对其进行染色，用流式细胞术检测分析各组Treg细胞的比例。

1.9实时荧光定量PCR法检测转录因子Foxp3的水平：细胞分组同1.8。细胞培养48h后，收集各组细胞。采用实时荧光定量PCR方法检测各组Treg细胞的转录因子Foxp3水平。

1.10ELISA法检测IL-10的水平：细胞分组同1.8。培养48h后，用ELISA方法检测各组细胞上清中IL-10的水平。

2 结 果

2.1成功建立CIA小鼠模型：小鼠加强免疫21d后，小鼠体重减轻，多处小溃疡在小鼠背部、尾根部皮内注射处形成，小鼠足爪充血红肿，运动明显受限。造模后26只小鼠的AI指数达4分以上，成模率为86.7%(26/30)。见图1。

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图1 CIA模型小鼠足爪和正常小鼠足爪

2.2MACS法分选的Treg细胞结果：MACS法分选出的Treg细胞经流式细胞术检测得纯度为91.66±0.12，纯度达90%以上。见图2。

图2 Treg细胞的纯度

2.3各组Treg细胞比例结果：穿龙薯蓣皂苷元作用MACS分选后的CIA小鼠Treg细胞48h，与空白对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组Treg细胞比率显著升高(P<0.05)。见图3，表1。

图3 穿龙薯蓣皂苷元作用后各组Treg细胞

2.4各组Foxp3 mRNA表达的结果：穿龙薯蓣皂苷元作用MACS分选后的CIA小鼠Treg细胞48h，与空白对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组Foxp3 mRNA表达显著升高(P<0.05)。见表2。

2.5各组IL-10水平的结果：穿龙薯蓣皂苷元作用MACS分选后的CIA小鼠Treg细胞48h，与空白对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组细胞上清中IL-10水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表1 穿龙薯蓣皂苷元对各组Treg细胞比例影响

表2 穿龙薯蓣皂苷元对各组细胞Foxp3 mRNA的影响

表3 穿龙薯蓣皂苷元对各组细胞上清中IL-10水平的影响

3 讨 论

RA是一种常见的致畸率很高的自身免疫病，严重影响患者的生活质量。Treg细胞是以表达CD4、CD25和Foxp3而命名的一类细胞，最显著功能是免疫抑制，其数量的增减以及功能的改变与多种疾病(自身免疫性疾病、感染、肿瘤等)密切相关[2]。

RA是以细胞免疫调节失衡为主的自身免疫病，Treg细胞在RA病程中的作用成为近年来研究的热点。研究发现RA组患者的Treg细胞比率较健康对照组有所下降[6]。RA患者Treg细胞还存在对CTLA-4介导的T细胞受体信号抑制的缺陷[7]。过继性Treg细胞免疫疗法成为治疗类风湿性关节炎的前沿疗法[8]。Foxp3是Treg细胞最特异的标记物，调控其生长、发育和免疫抑制功能，能反映Treg细胞的表达水平及细胞活性。IL-10是Treg细胞发挥抑制作用的主要细胞因子之一，它作用于多种免疫细胞，减少炎症介质的产生，限制炎症引起的过度组织破坏。

目前，尚无对RA根治的药物，多以缓解改善风湿症状的DMARDs药为主，且不良反应大。穿山龙作为传统中药，其具有舒筋活血、祛风、止咳平喘等功能。《类证治裁曰》“穿山龙，甘缓苦降，性温能通，活血舒筋，祛风止疼，用于各种风寒湿痹”。民间常用其水煎剂治疗关节炎、风湿痛等取得较好的疗效。本课题组前期研究证明穿龙薯蓣皂苷能缓解CIA模型鼠足爪肿胀程度、降低炎性细胞因子的表达、调节CD4+T细胞亚群[9，10]，对治疗RA具有一定作用。由于皂苷在机体内代谢后，最终被机体吸收并发挥治疗作用的有效成分是皂苷元，故本研究采用薯蓣皂苷元作为实验药物。CIA动物模型是RA经典动物模型，本研究采用免疫磁珠分离法分选出CIA小鼠脾脏高纯度的Treg细胞，直接对其进行药物研究，穿龙薯蓣皂苷元的作用更明确。本实验结果表明穿龙薯蓣皂苷元能显著提高CIA小鼠脾脏Treg细胞的比例、转录因子Foxp3和相关细胞因子IL-10的水平，为明确穿龙薯蓣皂苷对RA治疗的具体作用机制及新靶点确定提供实验依据。