miR-134调控CREB/BDNF通路参与脑卒中后抑郁的作用机制研究

李静，韩永凯，苏静，朱欣茹，宋景贵△

脑卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是脑卒中常见并发症，表现为情绪低落、兴趣减退、淡漠、反应迟钝等，至少1/3的脑卒中患者会出现心境改变［1］。临床常用的氟西汀、曲唑酮等药物治疗时间长且可能增加复发风险，因此需要寻找更为安全、有效、实用的治疗方法［2］。微小RNA（microRNA，miR）在肿瘤、心肌梗死、脑卒中、癫痫等疾病中参与多条信号通路，是脑卒中诊断、治疗及预后的新型生物标志物［3］。其中miR-134在脑组织中可通过改变树突棘的大小调节突触传递，研究发现在大脑海马组织中miR-134表达升高可降低突触可塑性和神经相关靶基因如环腺苷酸应答元件结合蛋白（CREB）、脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，引发癫痫等疾病［4］；而CREB、BDNF均为抗抑郁基因，其表达水平可直接反映抑郁情况［5］。笔者推测抑制miR-134的表达可缓解PSD的进展。因此，本研究通过观察下调miR-134表达对PSD模型大鼠的影响，以期为PSD的基因治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量220～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2017-0011；使用许可证号：SCXK（京）2018-0009］。所有动物均在温度（24.0±0.5）℃、湿度40%～60%、12 h光照/12 h黑暗环境中正常饮食饮水，实验经本院伦理协会审核并通过，伦理审批号：20180060015，整个动物实验期间严格遵循实验动物3R原则。实验细胞HEK-293T购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 试剂与仪器miRNA拮抗剂阴性对照（antagomir NC）、miR-134拮抗剂（miR-134 antagomir）、miR-134模拟物（miR-134 mimic）、mimic阴 性对照（mimic NC）、野生型（CREB-WT）和对应突变型（CREB-MUT）重组载体均购自上海吉玛基因股份有限公司；引物序列由上海生工生物工程有限公司设计并合成；蔗糖（批号20190553）购自上海佰晔生物科技公司。实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（批号20170526）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CREB（批号20180156）、BDNF（批号20170403）免疫组化染色试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号20185315）购自英国Abcam公司，qPCR仪购自美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及PSD大鼠模型建立实验动物编号后按照随机数字表法分为假手术组、模型组、antagomir NC组、miR-134 antagomir组，每组8只。除假手术组外，其余各组参考文献［6］进行大脑中动脉阻塞（MCAO）术，第2天经慢性不可预见温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）诱导建立PSD模型。假手术组除不插入线栓外其他操作相同。术后24 h按照Longa等［7］建立的评分标准，评分≥1分且＜4分纳入研究。MCAO术后第2天行CUMS前antagomir NC组、miR-134 antagomir组用立体定位仪定位双侧海马区并分别注射5μL antagomir NC、miR-134 antagomir（1μmol/L），之后5 d注射1次，连续5次。假手术组、模型组相同部位注射等体积生理盐水。

1.2.2 各组大鼠体质量变化分别在CUMS应激前，应激第7、14、21天测各组大鼠体质量。

1.2.3 动物敞箱实验评价大鼠运动行为改变实验在安静环境下进行，参考Papp等［8］所用敞箱，制作长宽均为80 cm、高40 cm敞箱，箱体四周为黑色，在敞箱白色底板上用黑色笔画出面积相等的25格。大鼠称质量后将大鼠置于敞箱中，记录5 min内大鼠穿越地面方块数（四爪跨入，即为水平活动得分）和直立总次数（两前肢均离地且1 cm以上，即为垂直活动得分）。

1.2.4 蔗糖偏爱实验评价大鼠快感缺乏行为改变所有大鼠在未分组前进行3次蔗糖偏爱实验训练，即在第1个24 h内每个笼中放置2个水瓶，均装1%蔗糖水；在第2个24 h内1个水瓶装1%蔗糖水、1个水瓶装纯净水。借鉴Willner等［9］方法并加以改进，动物敞箱实验结束后进行蔗糖偏爱实验。实验前禁食禁水24 h，1个水瓶装1%蔗糖水、1个水瓶装纯净水，1 h后称量剩余1%蔗糖水、纯净水量。计算糖水饮用比例=1%蔗糖水消耗量/（1%蔗糖水消耗量+纯净水消耗量）×100%。

1.2.5 qPCR检测海马CA1区miR-134、CREB、BDNF mRNA表达应激第21天蔗糖偏爱实验结束后立即处死大鼠，分离海马CA1区组织，部分置于4%多聚甲醛中固定做免疫组化染色，部分置于Trizol中研磨检测miR-134、CREB、BDNF mRNA水平。组织经研磨后参照qPCR试剂盒说明书进行实验。引物序列见表1。反应体系20μL：cDNA 1μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，2×Mix 10μL，ddH2O 8.0μL。反应条件：95℃10 min；95℃15 s，62℃45 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-134、CREB、BDNF mRNA表达水平。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 免疫组化染色检测海马CA1区CREB、BDNF蛋白表达情况取固定好的海马CA1区组织，4μm切片后经脱蜡、水化、热修复抗原、5%脱脂奶粉封闭，滴加一抗CREB（1∶500）、BDNF（1∶5 000）孵育2 h，滴加二抗20 min后DAB显色，苏木素复染核，分色、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察并记录CREB、BDNF阳性细胞数，每张切片选5个视野，取平均值。

1.3 双荧光素酶报告基因实验鉴定CREB与miR-134的靶向关系Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）分析显示CREB 3'UTR序列上存在miR-134潜在结合位点，见图1。因此构建含miR-134潜在结合位点的CREB-WT和CREBMUT，分别与miR-134 mimic或miR-134 mimic NC共转染至HEK-293T细胞中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性，验证CREB与miR-134的靶向关系。

Fig.1 Targetscan predicts the specific binding site of miR-134 to CREB图1 Targetscan预测miR-134与CREB的特异性结合位点

1.4 统计学方法运用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，计量数据均采用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠体质量情况比较应激前4组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。应激第7、14、21天，与假手术组相比，模型组和antagomir NC组大鼠体质量降低（P＜0.05）；与模型组和antagomir NC组相比，miR-134 antagomir组大鼠体质量升高（P＜0.05）。见表2。

Tab.2 Changes of body mass during the experiment in four groups of rats表2 4组大鼠实验期间体质量变化

2.2 4组大鼠运动行为改变见表3。动物敞箱实验结果显示，应激前，模型组、antagomir NC组、miR-134 antagomir组水平和垂直活动得分均较假手术组降低（P＜0.05）。应激第7、14、21天，模型组和antagomir NC组水平和垂直活动得分仍较假手术组降低（P＜0.05），miR-134 antagomir组与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组、antagomir NC组相比，miR-134 antagomir组应激第14、21天水平、垂直活动得分升高（P＜0.05）。

Tab.3 Comparison of the movement between four groups of rats表3 4组大鼠运动情况比较

2.3 4组大鼠蔗糖偏爱实验结果 应激前和应激第7天，4组大鼠糖水饮用比例差异无统计学意义（P＞0.05）。应激第14天，与假手术组相比，模型组、antagomir NC组和miR-134 antagomir组糖水饮用比例下降（P＜0.05）；应激第21天，与假手术相比，模型组和antagomir NC组糖水饮用比例下降（P＜0.05），miR-134 antagomir组糖水饮用比例高于模型组和antagomir NC组（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of sugar water drinking ratio between four groups of rats表4 4组大鼠糖水饮用比例比较

2.4 4组大鼠海马CA1区miR-134、CREB、BDNF mRNA表达水平变化与假手术组相比，模型组大鼠海 马CA1区miR-134水 平 升高，CREB、BDNF mRNA水平降低（P＜0.05）；与模型组和antagomir NC组相比，miR-134 antagomir组海马CA1区miR-134水平降低，CREB、BDNF mRNA水平升高（P＜0.05）。见表5。

Tab.5 Comparison of miR-134,CREB,BDNF mRNA levels in hippocampal CA1 area between 4 groups of rats表5 4组大鼠海马CA1区miR-134、CREB、BDNF mRNA水平比较

2.5 4组大鼠海马CA1区CREB、BDNF蛋白表达变化免疫组化染色结果显示，CREB阳性细胞表达呈棕色且多数位于细胞核，BDNF阳性细胞表达呈棕色斑块，多数位于细胞质，少量位于神经突起。与假手术组相比，模型组海马CA1区CREB、BDNF阳性细胞数减少（P＜0.05）；与模型组和antagomir NC组相比，miR-134 antagomir组海马CA1区CREB、BDNF阳性细胞数增多（P＜0.05）。见表6、图2。

Tab.6 Comparison of CREB and BDNF positive cells in hippocampal CA1 area between four groups of rats表6 4组大鼠海马CA1区CREB、BDNF阳性细胞数比较

2.6 双荧光素酶报告基因实验结果与miR-134 mimic NC+CREB-WT组 相 比，miR-134 mimic+CREB-WT组共转染细胞荧光素酶相对活性下降（n=6，0.99±0.11vs.0.43±0.07，t=10.521，P＜0.05）；miR-134 mimic NC+CREB-MUT与miR-134 mimic+CREB-MUT共转染细胞荧光素酶相对活性差异无统计学意义（n=6，1.03±0.10vs.1.01±0.11，t=0.330，P＞0.05），证明CREB序列上存在miR-134特异结合位点。

Fig.2 CREB and BDNF protein expressions in hippocampal CA1 area of 4 groups of rats(Immunohistochemistry staining,×200)图2 4组大鼠海马CA1区CREB、BDNF蛋白表达情况（免疫组化染色，×200）

3 讨论

PSD是多种精神和躯体症状综合的复杂性情感障碍疾病，会引发注意力低下、学习及执行力降低、肢体功能和生活质量下降等，同时造成神经功能障碍，严重时导致患者自杀［10］，早期有效的治疗对于缓解疾病意义重大。在众多造成抑郁的病因中，MCAO后创伤性应激是主要原因之一［11］。因此，本文采用MCAO后CUMS诱导建立PSD大鼠模型，在应激前，应激第7、14、21天分别称量动物体质量、进行动物敞箱实验和蔗糖偏爱实验，从而评价大鼠抑郁样行为。与假手术组相比，模型组在应激后体质量减轻，运动状况、饮用糖水情况均降低，抑郁样行为加重。

随着分子技术的发展，miRNA靶向治疗优势明显，miRNA可特异性地靶向目标片段或目标3'-UTR突变体，调节靶基因的表达，进而影响疾病的进展［12］。且miRNA在组织、细胞、血液中能够稳定表达，相较于各类神经生化递质、细胞因子等，更适合作为生物标志物［13］。研究发现miR-134可参与树突棘大小变化、神经元可塑性等过程来影响脑发育；miR-134的靶基因LIM区域激酶1（LIMK1）可影响树突棘的大小，当miR-134水平升高时抑制LIMK1 mRNA翻译，从而导致树突棘变小，而树突棘作为神经元树突上功能性突起，参与大脑学习记忆功能，且与中枢神经系统疾病关系密切［14-16］。本研究发现，与假手术组相比，模型组海马CA1区miR-134水平升高，提示在PSD海马CA1区miR-134导致树突棘变小，神经功能改变，大鼠表现出抑郁样行为。而在模型组基础上注射miR-134 antagomir后，抑郁样行为得以减缓，推测miR-134可能为疾病治疗靶位点之一，具有一定改善抑郁的作用。

CREB是细胞核内重要转录因子，CREB活化后在突触可塑性、学习记忆等方面发挥重要作用，是神经通路重要靶点［17］；BDNF可解除LIMK1的抑制作用，从而诱导树突棘生长［18］。CREB可通过促进BDNF的表达，加速神经突触重塑和神经元生长，有助于抑郁症的治疗［19］。研究发现在癫痫大鼠中miR-134的表达水平下降，CREB、突触核蛋白11（SYT11）表达水平升高，干扰miR-134可使CREB、SYT11的表达升高，并伴随大鼠癫痫发作频率增多、程度加重［20］。本研究发现，与假手术组相比，模型组海马CA1区CREB、BDNF mRNA和蛋白表达水平降低，提示PSD海马CA1区CREB表达降低可同时降低对BDNF的促进作用，从而使BDNF对LIMK1的抑制作用减弱，导致树突棘生长受到抑制，进而影响神经功能。与模型组相比，miR-134 antagomir组海马CA1区CREB、BDNF mRNA和蛋白表达水平升高；进一步研究发现，Targetscan预测miR-134与CREB可能存在特异性结合位点，经双荧光素酶验证CREB序列上确实存在miR-134特异结合位点，提示抑制miR-134的表达可靶向促进CREB的mRNA翻译，从而促进抗抑郁基因BDNF的表达，解除LIMK1的抑制，进而实现抗PSD作用。

综上所述，抑制miR-134的表达可能靶向促进CREB/BDNF通路蛋白的表达，发挥抗抑郁作用，实现对PSD大鼠的保护，但miR-134靶向信号通路不止一个，亦可能通过其他信号通路实现对PSD大鼠的保护，这是今后的研究重点。