钙敏感受体在胰岛素抵抗状态下肾动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用

李光伟，李 波，金 莉，邱丽萍，张亚珍，吴淑琴

(齐齐哈尔医学院 1. 病理生理学教研室、2.机能实验教学中心、3.病理学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是危害人类健康的常见的慢性代谢性疾病，发病率逐年提高，我国是DM患者最多的国家之一，DM血管病变是其致死致残的主要原因[1-2]。DM血管病变的重要特点是动脉粥样硬化，动脉平滑肌细胞增生和迁移是其发生的原因之一。DM血管病变以及血管平滑肌功能紊乱是多因子参与的复杂网络调控过程[3]。研究表明[4]，钙离子和钙信号转导在动脉中膜平滑肌细胞表型改变以及增生、迁移过程中发挥重要作用。

钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)是一种G蛋白偶联受体，在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡等过程中发挥重要作用[5]。近年来，越来越多的研究显示，心血管系统中有CaSR的全长表达，并在血管收缩与动脉粥样硬化等生理及病理过程中发挥调节功能[6]。但是CaSR在糖尿病肾动脉硬化中的作用尚无报道。根据文献调研与前期预实验情况，我们推测：CaSR可能参与糖尿病肾动脉平滑肌细胞(renal artery smooth muscle cell，RAMSC)增生及迁移的发展过程。为证明此假说，我们做如下研究，以期为糖尿病肾动脉硬化的临床治疗提供新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康Wistar大鼠，体质量(200±20)g，♂，SPF级。由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。动物许可证号：SYXK(黑)2008004。

1.1.2主要试剂 CaSR抗体(sc-47741，Santa)；PCNA抗体(sc-25280，Santa)；MMP-2抗体(sc-13595，Santa)；α-SMA抗体(BM0002，博士德)；NPS2143(sc-361280A，Santa)；GdCl3(sc-224004，Santa)；胰岛素(CI6561，coolader)；细胞周期试剂盒(G019，南京建成)；MMP-2 ELISA检测试剂盒(H146-1，南京建成)；Transwell小室(3422，corning)；DAB显色试剂盒(AR1022，博士德)；即用型SABC试剂盒(SA1025，博士德)。

1.1.3主要仪器 倒置显微镜(Olympus)；DF-D 型恒压恒流电泳仪(北京六一厂) ；高速离心机(Sigma)；化学发光成像系统(上海天能)；流式细胞仪(Becton Dickinson)；激光共聚焦显微镜(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1大鼠肾动脉平滑肌细胞的原代培养 wistar大鼠处死，无菌条件下迅速取肾动脉，冷 PBS 漂洗，剔掉多余组织。纵向剖开，轻刮内膜。中膜在冷 PBS 中漂洗，切成约 1 mm2组织块，均匀贴于培养瓶底部，将培养瓶翻转置于培养箱中 5-6 h，加入20%胎牛血清的DMEM 培养基，将培养瓶翻转过来，静置培养。

1.2.2大鼠肾动脉平滑肌细胞鉴定 细胞丙酮固定，PBS洗；0.5% H2O2稀释的甲醇室温20 min，PBS洗；山羊血清室温20 min；α平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)抗体4 ℃过夜；PBS洗，二抗37 ℃ 30 min，PBS洗；SABC 37 ℃孵育20 min，DAB显色10 min；自来水冲洗，苏木精复染，二甲苯透明，封片。

1.2.3实验分组及模型的复制 成对数生长的RAMSC无血清培养24 h，加入药物干预，分组如下，对照组：正常细胞培养(含5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养基)，不做任何处理；单纯模型组(高糖+高胰岛素)：加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰岛素(10-7mol·L-1)作用72 h；模型+CaSR激动剂：加入GdCl3(30 μmol·L-1)4 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰岛素(10-7mol·L-1)作用72h；模型+CaSR抑制剂：加入NPS2143(10 μmol·L-1) 12 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰岛素(10-7mol·L-1)作用72 h。

1.2.4Western blot检测CaSR、PCNA及MMP-2的蛋白水平 细胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，上清液进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，90 mV转移2 h至硝酸纤维素薄膜，封闭1.5 h；分别加入一抗CaSR、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP-2)(1 ∶500) 4 ℃过夜。洗膜，二抗(1 ∶10 000)孵育1 h，ECL发光，半定量分析 。

1.2.5细胞增殖周期的检测 各组细胞胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，细胞密度为1×106·L-1，离心2 000 r·min-1，5 min，PBS洗，离心同前，加3 mL预冷乙醇固定，4 ℃过夜，离心2 000 r·min-1，5 min，缓冲液洗涤，离心同前，加A液250 μL，室温孵育10 min，加B液200 μL，室温孵育10 min，加预冷C液200 μL，室温避光10 min，上机检测。

1.2.6Transwell小室法检测细胞迁移 各组细胞离心，调整细胞浓度1.0×109/L种于上室，下室加入含有10% FBS的完全培养基600 μL，据分组情况向上室内加入不同药，培养72 h；上室取出后去除未迁移的细胞，PBS洗；甲醇固定上室细胞20 min；PBS洗，风干，0.5%结晶紫染色20 min，PBS洗，风干。将小室倒立，400倍正置显微镜下任意选取5个不同的视野，拍照并计数穿膜细胞数量。

1.2.7ELISA法检测MMP-2含量 取各组细胞培养液，离心1 500 r·min-110 min，取1 mL上清液待测。按ELISA试剂盒说明书操作。各组均进行3个复孔检测，均值为终质量浓度。分别以标准物的质量浓度及450 nm波长的吸光度值为横纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线。在坐标曲线上通过样品A值，查出相应的样品质量浓度。

1.2.8细胞内钙离子浓度的检测 细胞弃培养液，含钙Krebs溶液冲洗。Fluo-4 AM 37 ℃避光孵育30 min；去除负载液，含钙Krebs溶液冲洗，备用。在镜下选取细胞状态好，质膜完整的细胞进行实验。用激光扫描共聚焦显微镜监测细胞内钙离子的变化，激发波长为488 nm。

2 结果

2.1 大鼠肾动脉平滑肌细胞鉴定为鉴定提取的原代大鼠RASMC，我们进行抗α-SMA免疫组化染色。结果如Fig 1，胞质染成黄褐色，胞核不着色，胞质中有较多的条丝状物，与细胞纵轴平行，即为肌动蛋白。计数200个细胞，见10个细胞未染色，平滑肌细胞的纯度为95%。

Fig 1 Identification of RASMCs (immunohistochemical staining ×400)

2.2 不同药物处理对CaSR表达的影响为探究胰岛素抵抗对CaSR表达的影响，我们通过Western blot实验检测了不同药物处理后CaSR蛋白的表达情况。结果如Fig 2，与control组比较，HG+HI组CaSR表达增加(P<0.05)；与HG+HI组比较，GdCl3能增加CaSR表达(P<0.05)，CaSR抑制剂NPS2143的作用相反。

Fig 2 Effects of different treatment factors on

2.3 不同药物处理对PCNA蛋白表达的影响PCNA是反映细胞增殖状态的良好指标，为观察CaSR活化对RASMC增殖的影响，我们观察了不同药物处理后PCNA蛋白表达的变化。结果显示(Fig 3)：与control组比较，高糖和高胰岛素能够上调PCNA蛋白表达水平(P<0.05)；在此基础上GdCl3能够进一步增加其表达水平(P<0.05)； NPS2143则与GdCl3作用相反。

Fig 3 Effects of different treatment factors on PCNA

2.4 不同药物处理对细胞周期及细胞增殖指数的影响为进一步探究CaSR活化对RASMC增殖的影响，我们又观察了不同药物作用后细胞周期及细胞增殖指数的变化。细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1)。结果显示：高糖和高胰岛素组S和G2/M期细胞数量增多，PI高于对照组(P<0.05)，CaSR激动剂组PI高于HG+HI组(P<0.05)，NPS2143组PI明显低于HG+HI组(P<0.05)，如Fig 4。

Fig 4 Effects of different treatment factors on cell cycle n=3)

2.5 不同药物处理对细胞迁移的影响为研究CaSR活化对RASMC迁移的影响，我们做了Transwell小室实验。结果显示(Fig 5)：HG+HI组平均每个高倍视野穿过滤膜的细胞数明显增加(P<0.05与control组比较)，提示高糖和高胰岛素可增加RASMC的运动侵袭能力。高糖和高胰岛素基础上NPS2143能抑制细胞迁移，GdCl3能促进其迁移(P<0.05)。

Fig 5 Effects of different treatment factors

2.6 不同药物处理对MMP-2蛋白表达的影响MMP-2能够降解细胞外基质，在细胞迁移过程中发挥重要作用，为观察其在CaSR活化对RASMC迁移中的作用，我们通过Westen blot实验检测了不同药物处理情况下MMP-2蛋白表达的变化。如Fig 6所示，HG+HI组MMP-2蛋白表达增加(P<0.05与control组比较)；高糖和高胰岛素基础上GdCl3和NPS2143分别能上调和下调这种作用(P<0.05与HG+HI组比较)。

2.7 不同药物处理对细胞分泌MMP-2的影响为观察MMP-2在CaSR活化对 RASMC迁移中的作用，我们又检测了细胞上清液中的MMP-2含量。如Fig 7，HG+HI组细胞上清液中的MMP-2蛋白含量高于对照组(P<0.05)，但却明显低于HG+Gd组(P<0.05)，NPS2143则与GdCl3作用相反。

2.8 不同药物处理对细胞内钙离子浓度的影响为揭示CaSR活化促进RASMC增殖和迁移的机制，我们检测了不同药物处理后细胞内钙离子浓度的变化。在HG+HI组细胞内钙浓度增加(P<0.05与control组比较)，HG+Gd组细胞内钙离子浓度进一步上升(P<0.05与HG+HI组比较)，HG+NPS组钙离子浓度下降(P<0.05与HG+HI组比较),如Fig 8所示。

Fig 6 Effects of different treatment factors on

Fig 7 Effects of different treatment factors on secretion of MMP-2 by RASMCs n=3)

3 讨论

近年来，DM已成为威胁人类生命健康的“甜蜜杀手”，我国是DM患者最多的国家之一。作为慢性代谢性疾病DM有多种并发症：严重代谢紊乱、感染性疾病、血管的病变及糖尿病足等，其中血管病变是DM致死致残的主要原因[3]。DM大血管病变的临床特点是血管功能及结构异常，包括动脉硬化斑块形成、血管僵硬度增加等。与其他血管损伤不同的是DM血管病变内环境紊乱更加复杂，高血糖、胰岛素抵抗及脂代谢紊乱等导致内皮细胞更易损伤。失去内皮保护的中膜平滑肌细胞暴露于多重刺激下,发生增殖、迁移并合成大量的细胞外基质，沉积于血管壁[7]。研究表明[4]，钙离子和钙信号转导在动脉中膜平滑肌细胞表型改变以及增生、迁移过程中发挥重要作用。

Fig 8 Effects of different treatment factors on calcium ion concentration n=3)

钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)是一种G蛋白偶联受体，参与体内很多重要的病理生理过程。近年来，CaSR在心血管系统中的功能及其在代谢性疾病，如高血压、肺动脉高压及糖尿病性心肌病变等中的作用正在被逐步揭示[8-10]。有学者研究发现CaSR在动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞以及气道平滑肌细胞中有表达,其活化影响细胞的增殖和迁移[11-12]。尽管CaSR 与动脉粥样硬化关系密切，但其在DM血管病变中的作用却鲜有报道。

高血糖及胰岛素抵抗是DM患者的重要内环境特征，也是引起机体出现各种病理改变的基础。Malecki等[13]发现DM患者单核细胞CaSR表达增多，并依赖于空腹血糖浓度。Lu等[14]研究证实高糖促进大鼠主动脉内皮细胞CaSR的表达，并可能参与内皮细胞凋亡过程。本研究结果显示：大鼠RASMC中存在CaSR蛋白的表达，高糖和胰岛素能使其表达增加，CaSR激动剂上调此作用，抑制剂则相反，提示胰岛素抵抗能够活化大鼠RASMC的CaSR。

平滑肌细胞增殖是动脉硬化的重要原因，Zhu等[15]研究表明，在CaSR shRNA大鼠，吸烟引起的肺动脉增生明显减弱。新近研究揭示缺氧活化的CaSR促进人肺动脉平滑肌细胞增殖和表型转化，进而促进肺动脉高压的发生和发展[4]。我们的结果亦显示高糖和胰岛素能促进RASMC增殖。这些作用能够被CaSR激动剂GdCl3所增强，被其抑制剂所减弱，提示胰岛素抵抗活化的CaSR参与了RASMC的增殖过程，是导致DM患者发生肾动脉硬化的原因之一。

血管平滑肌细胞迁移和表型改变是导致DM血管损伤的重要因素。Brennan等[16]研究表明活化的CaSR能够促进肿瘤细胞转移，比如乳腺癌、前列腺癌等。本研究结果提示：胰岛素抵抗活化的CaSR促进RASMC迁移过程。血管平滑肌细胞迁移受很多因素的影响，MMP是一类能够降解细胞外基质的蛋白酶家族，通过改变细胞和基质的结合特性协助细胞迁移，在肿瘤细胞的浸润、转移中起促进作用。MMP-2是血管平滑肌细胞中表达的一种重要的MMP，能水解Ⅳ型胶原，是细胞穿越基底膜过程的重要物质。本实验结果提示，胰岛素抵抗活化的CaSR通过增加MMP-2蛋白的表达，增强其降解细胞外基质作用进而促进细胞迁移的进程。

同时，我们观察到细胞内钙离子浓度随着细胞增殖及迁移的程度而同步变化，钙离子浓度升高，细胞的增殖及迁移指标相应上调，而钙离子浓度下降后，细胞增殖及迁移指标也随之相应下调。Lu等[17]报道：在缺氧条件下CaSR通过IP3受体导致钙离子从肌浆网释放，进而促进心肌细胞凋亡。本实验结果提示：在胰岛素抵抗活化的CaSR所介导RASMC增殖及迁移的过程中，钙离子也起到了类似的中继作用，并且促进了细胞的增殖与迁移。

综上，胰岛素抵抗活化的CaSR促进RASMC的增殖与迁移过程，进而参与DM肾血管硬化的形成，且钙离子在此过程中扮演了重要的角色。本研究为DM肾动脉硬化的临床治疗提供了新思路与新视角。但由于本研究为体外细胞实验，尚未建立动物模型验证，另外细胞内钙离子浓度增加通过哪些具体分子机制促进RASMC的增殖和迁移，这些问题仍有待后续研究。