PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3诱导鼻咽癌细胞凋亡中的调控作用

周芳亮，胡 晶，蔺 婷，何 兰，范婧莹，罗晶婧，王贤文，何迎春,4，廖端芳

(湖南中医药大学 1. 中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室、2.湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室、 3.医学院，4. 湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心，湖南 长沙 410208)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种鳞状上皮细胞癌，高发于我国南方各省、东南亚地区以及北非。由于NPC原发病灶多在咽隐窝，解剖学位置特殊，发病过程隐匿，且其周围淋巴组织较丰富，容易发生淋巴转移，故70%的新诊断NPC病例已为晚期(III或IV期)，此类病人预后较差[1]。因此，寻求一种安全高效的治疗方法和药物是NPC临床治疗过程中迫切需要解决的问题。

中医认为“气虚染毒”是NPC的病因病机，益气解毒是其治疗原则[2-3]。黄连性寒，人参性温，配伍同用，则一苦一甘，一攻一补，相反相成，相济相佐，为益气、解毒并用之法。小檗碱和人参皂苷Rg3是中药黄连和人参的活性成分，近年来均被证实可通过抑制细胞增殖和侵袭，阻滞细胞周期以及诱导细胞凋亡等机制发挥抗癌作用[4-6]。将两者组合使用既可继承中药复方配伍增效的传统优势，又能满足成分清晰、质量可控的现代中药开发要求，有望成为治疗NPC的潜在药物。我们的前期研究发现，小檗碱联合人参皂苷Rg3可发挥协同抗NPC的作用[7]，但其具体机制仍未完全明了。PI3K/Akt信号能被细胞内多种物质(激素、生长因子、细胞外基质成分等)激活，使得下游靶蛋白发生磷酸化，从而在调控细胞的生长、存活、自噬和凋亡等方面发挥着重要的作用[8]。而目前尚无PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3抗NPC中的作用的研究。因此，为进一步探究小檗碱联合人参皂苷Rg3抗NPC的作用机制，研究探讨小檗碱联合人参皂苷Rg3能否通过抑制PI3K/Akt信号通路，调控增殖、凋亡相关蛋白的表达，从而达到协同抗NPC的作用。该研究有助于我们进一步阐明小檗碱联合人参皂苷Rg3抗NPC的协同效应及作用机制，为其临床应用奠定基础，同时可为益气解毒类中药的现代开发提供新方向。

1 材料

1.1 细胞株人鼻咽癌细胞株CNE2、6-10B购自北京北納创联生物技术研究院，由本实验室传代培养。

1.2 药物与试剂小檗碱(上海金穗生物科技有限公司，批号2086-83-1)；人参皂苷Rg3(上海金穗生物科技有限公司，批号14197-60-5)；SC79(MCE公司，批号HY-18749)；LY294002(MCE公司，批号HY-10108)；RPMI-1640培养基(Hyclone公司，批号SH30809.01B)；胎牛血清(Gibco，批号10099-141)；0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液(Beijing Solarbio公司，批号T1320)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD公司，批号556547)；BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪公司，批号CW0014S-500T)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(康为世纪公司，批号CW0022S)；蛋白Marker(Thermo公司，批号26616)；Hoechst 33342(翊圣生物科技有限公司，批号40731ES10)；anti-β-actin(CST，批号4970S)，anti-Survivin(CST，批号2808)，anti-PCNA(CST，批号13110)，anti-Bax(CST，批号2772)，anti-Bcl-2(CST，批号2870)，p-Akt信号通路抗体检测盒(CST，批号9916S)，anti-PI3 p110a(CST，批号4249S)。

1.3 主要仪器倒置显微镜(CKX31)(Olympus公司)；CO2培养箱贺利氏HERAcell150i (赛默飞世尔公司)；全自动酶标分析仪(ELX800)(BioTek公司)；精密恒温水槽(BWS-12)(上海一恒科学有限公司)；电热恒温干燥箱(202-1AB)(天津市泰斯特仪器有限公司)；实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)(艾森生物科技公司)；荧光双染流式细胞仪Cellometer Image Cytometer(K2)(Nexcelom公司)；荧光倒置光学显微镜及图像采集系统(Olympus公司)；多功能荧光成像仪(LI-COR公司)。

2 方法

2.1 细胞培养将CNE2及6-10B细胞培养于含10%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺和100 kU·L-1青霉素-链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中。

2.2 药物的配置将小檗碱、人参皂苷Rg3、顺铂、SC79、LY294002用DMSO溶解，分别制成相应浓度的药物母液，分装后-20 ℃避光保存；临用时用RPMI 1640完全培养液稀释，配成所需要的工作浓度。

2.3 实时无标记细胞功能分析仪(Real Time Cellular Analysis，RTCA)监测细胞增殖情况药物单用：不同浓度的小檗碱(0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1)和人参皂苷Rg3(0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1)分别处理CNE2细胞，同时设置溶剂对照组(0.1% DMSO)、阳性对照组(顺铂，15 μmol·L-1)和空白组(只加培养液、不加CNE2细胞)。

药物联合：选择0.125 IC50、0.25 IC50、0.5 IC50、IC50、2 IC50浓度的小檗碱和人参皂苷Rg3联合处理鼻咽癌CNE2细胞，同时设置溶剂对照组、阳性对照组和空白组。

取对数生长期细胞，消化重悬为单个细胞，按照5×103个细胞/孔接种到RTCA专用细胞增殖检测培养板，每个孔加入100 μL细胞悬液。待细胞指数(cell index，CI)达到1.0时按分组加入不同浓度的药物。每个组设5个复孔，每孔加入药物体积为200 μL，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。采用RTCA实时监测，以CI作为细胞增殖情况。CI=(Rn-Rb)/15，其中Rn表示孔接种有细胞时的电极阻抗值，Rb表示孔中只有培养基时的背景阻抗值。根据曲线分析小檗碱、人参皂苷Rg3药效随浓度及时间变化的特征，并用仪器自带的软件计算出合适时间点的半数抑制率浓度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)。

采用联合作用指数(combined index，CI) 分析小檗碱和人参皂苷Rg3对鼻咽癌细胞增殖是否有协同抑制效应。选出协同抑制效应最强的联合用药浓度用于后期实验，小檗碱和人参皂苷Rg3单用的浓度均同联合使用时的浓度。

2.4 细胞凋亡检测实验分组：将细胞分成5组：①溶剂对照组：0.1%DMSO；②小檗碱组：10 μmol·L-1Ber；③人参皂苷Rg3组：5 μmol·L-1Rg3；④小檗碱+人参皂苷Rg3组：10 μmol·L-1Ber+5 μmol·L-1Rg3；⑤阳性对照组：15 μmol·L-1顺铂。

2.4.1Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡形态 取对数生长期CNE2细胞，消化重悬为单个细胞，按1×105个细胞/孔接种到6孔板中，培养12 h后，根据实验分组加入不同浓度的药物分别干预CNE2细胞48 h，用PBS漂洗2次，每孔加入1mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色液，于培养箱中避光染色20 min，吸尽Hoechst 33342染色液，再用PBS漂洗3次，于荧光倒置显微镜下观察CNE2细胞核形态和染色情况，拍照，重复3次。

2.4.2流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期CNE2细胞，消化重悬为单个细胞，按3×105个细胞/皿接种到60 mm培养皿中，培养12 h后，根据实验分组加入不同浓度的药物分别培养48 h，用胰酶(不含EDTA)消化重悬，800 r·min-1离心3 min，弃上清，用1 mL PBS漂洗3次，用1×Binding buffer重悬细胞，调整细胞密度为2×1010个·L-1。将100 μL各组细胞分别移入EP管，加入5 μL FITC和5 μL PI，混匀后避光染色15 min，加入100 μL 1×Binding buffer终止染色，30 min内从各EP管中取20 μL染色液上机检测细胞凋亡，并用FCS Express 6 Flow Research Edition软件分析各组细胞凋亡情况。实验重复3次。

2.5 Western blot检测相关蛋白的表达CNE2细胞经不同组药物处理36 h后，加入含1%PMSF的RIPA裂解液处理15 min，4 ℃条件下1 000×g离心 5min后取上清，BAC法测定蛋白浓度。每组取30 μg总蛋白，10% SDS-PAGE分离蛋白，运用电转移法将蛋白转移至PVDF膜。含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h后加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后孵育二抗1 h，洗膜后放入Odyssey荧光成像仪中，显影，并分析各蛋白条带的相对灰度值。

3 结果

3.1 小檗碱联合人参皂苷Rg3对CNE2细胞增殖的影响RTCA结果显示，小檗碱、人参皂苷Rg3的增殖曲线皆低于溶剂对照组(Control)，表明两药单用能够抑制CNE2细胞增殖，且抑制效果与药物浓度的增加相关(Fig 1)。小檗碱24 h、48 h、72 h IC50值分别为(31.06±0.27)、(21.71±0.58)、(17.50±0.35) μmol·L-1，人参皂苷Rg3 24 h、48 h、72 h IC50值分别为(36.62±0.37)、(26.82±0.43)、(21.87±1.10) μmol·L-1。其中，20 μmol·L-1小檗碱在不同时间点对CNE2细胞的抑制率分别为(42.12±0.30) %(24 h)、(48.63±0.64) %(48 h)和(52.9±0.32) %(72 h)，均接近50%，因此在后续实验中我们将20 μmol·L-1视为小檗碱的IC50值。

将2.5 μmol·L-1(0.125 IC50)、5 μmol·L-1(0.25 IC50)、10 μmol·L-1(0.5 IC50)、20 μmol·L-1(IC50)、40 μmol·L-1(2 IC50)浓度的小檗碱和对应不同浓度的人参皂苷Rg3联合作用于CNE2细胞，RTCA显示不同浓度小檗碱和人参皂苷Rg3联用后，药物均可以抑制CNE2细胞的增殖(Fig 2)。

利用CompuSyn 软件计算不同浓度组合下两药联用的CI值，发现10 μmol·L-1的小檗碱与5 μmol·L-1Rg3 联用时CI值为0.663±0.022，CI<1，具有较好的协同效应，故后期选择该浓度组合进行研究。

Fig 1 Inhibition of berberine or ginsenoside Rg3 on proliferation of CNE2 cells by RTCA

Fig 2 Inhibition of different concentrations of berberine combined with ginsenoside Rg3 on proliferation of CNE2 cells

为了进一步研究小檗碱和人参皂苷Rg3联合用药的效应，我们采用10 μmol·L-1的小檗碱与5 μmol·L-1Rg3进行联合用药研究。RTCA显示，10 μmol·L-1小檗碱与5 μmol·L-1人参皂苷Rg3联合处理CNE2及6-10B细胞后对细胞增殖的抑制作用均明显强于同浓度单药组(Fig 3)。

3.2 小檗碱联合人参皂苷Rg3对CNE2细胞凋亡的影响

3.2.1Hoechst 33342染色观察细胞形态 Hoechst 33342染色结果显示：溶剂对照组细胞的细胞核完整，呈均匀一致的淡蓝色微弱蓝光。小檗碱和人参皂苷Rg3单独处理后的细胞出现凋亡特征，即部分细胞核呈颗粒状亮蓝色，同时伴有细胞核的边集、碎裂、皱缩等，且随作用时间的延长，凋亡特征越明显。而小檗碱与人参皂苷Rg3联合用药组大量细胞出现染色荧光加强、核染色质浓缩等典型细胞凋亡现象，且凋亡特征较两单药组更明显(Fig 4)。

3.2.2流式细胞术检测细胞凋亡 48 h后小檗碱组凋亡率为(48.29±0.76)%，其中早凋细胞占(44.62±0.67)%。人参皂苷Rg3组凋亡率为(31.57± 1.21)%，其中早凋细胞占(25.87±0.95)%。而小檗碱联合人参皂苷Rg3组凋亡率明显上升，为(68.24±1.10)%，分别是小檗碱组和人参皂苷Rg3组的1.41倍和2.16倍，其中早凋(56.24±0.76)%。顺铂组凋亡率为(70.41± 1.49)%，其中早凋细胞占(62.57±1.35)%(Fig 5)。

以上结果表明，小檗碱和人参皂苷Rg3联合用药诱导鼻咽癌CNE2细胞凋亡的作用比单独使用小檗碱或人参皂苷Rg3时更强，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.3 小檗碱联合人参皂苷Rg3对鼻咽癌CNE2细胞PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的影响Western blot结果显示，各药物组细胞总Akt的表达量与溶剂对照组相比没有明显变化，但PI3K p110α和Thr308 磷酸化的Akt(p-Akt)在小檗碱联合人参皂苷Rg3组细胞中的表达明显低于其它3个组细胞(P<0.05)(Fig 6)。这提示小檗碱联合人参皂苷Rg3可能通过作用于PI3K/Akt信号通路来抑制体外CNE2细胞的增殖，诱导细胞凋亡。

3.4 PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制CNE2细胞增殖及诱导凋亡中的调控作用为进一步研究 PI3K/Akt信号通路是否在小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制CNE2细胞增殖、诱导细胞凋亡中发挥关键作用，将细胞分为：溶剂对照组(Control)、小檗碱(10μmol·L-1)+人参皂苷Rg3(5μmol·L-1)组 ，PI3K/Akt信号通路的激活剂(SC79：12.5μmol·L-1)组、SC79+小檗碱 +人参皂苷Rg3组、PI3K/Akt信号通路的抑制剂(LY294002：50μmol·L-1)组。Westernblot结果显示，与溶剂对照组相比，小檗碱+人参皂苷Rg3组、LY294002组、SC79+小檗碱+人参皂苷Rg3组p-Akt的表达均下降(P<0.05)；且较小檗碱+人参皂苷Rg3组，p-Akt在SC79+小檗碱+人参皂苷Rg3组细胞中的表达量相对上升(P<0.05)；而Akt总蛋白表达量在各组间差异无显著性(Fig7)。流式结果显示，细胞凋亡率由高到低为：LY294002组、小檗碱+人参皂苷Rg3组、SC79+小檗碱+人参皂苷Rg3组、Control组、SC79组(Fig8)。RTCA结果显示，各组细胞增殖能力与凋亡情况相反(Fig9)。Westernblot进一步检测发现：小檗碱+人参皂苷Rg3组、LY294002组及SC79+小檗碱+人参皂苷Rg3组中Bax表达较溶剂对照组皆增高，而Bcl-2、Survivin和PCNA表达量下降(P<0.05)。SC79+小檗碱+人参皂苷Rg3组中Bax的表达较小檗碱与人参皂苷Rg3联合组相对下调；而Bcl-2、Survivin及PCNA表达量升高(P<0.05)(Fig10)。即PI3K/Akt信号通路激活后，小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制CNE2细胞增殖和诱导细胞凋亡的效应降低，抗凋亡蛋白和增殖相关蛋白表达量增加，凋亡相关蛋白表达下降。

Fig 3 Inhibition of berberine and ginsenoside Rg3 on proliferation of NPC cells A： CNE2 cells； B： 6-10B cells.

Fig 4 Effect of berberine and ginsenoside Rg3 on apoptosis morphology of CNE2 cells (bar=100 μm, 200×)

Fig 5 Effect of berberine and ginsenoside Rg3 on apoptosis rate of CNE2 cells n=3)

Fig 6 Effect of berberine combined with ginsenoside Rg3 on expression of key proteins in PI3K/Akt pathway in CNE2 cells n=3)

Fig 7 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on expression of key proteins in pathway n=3)

Fig 8 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 induced apoptosis n=3) *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs Ber+Rg3 group

Fig 9 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 inhibition of cell proliferation by RTCA

4 讨论

NPC是一种最常见的鳞状上皮细胞癌，高发于东南亚和北非地区，尤其是我国南方各省[9]。最新世界肿瘤统计数据显示，2018年全球NPC新增病例约129 079例，死亡72 987例，其中超过45%的新病例位于我国，且发病率呈逐年增加趋势，严重威胁了人民的身体健康[10]。放疗与化疗是目前比较有效的治疗NPC的方法，但晚期高分化患者对放疗敏感度较差，预后效果不佳，容易复发甚至转移。而常规化疗药物毒副作用大、单一药物易产生耐药性，使得鼻咽癌患者的疗效和生活质量明显下降[11]。因此，寻求一种更加安全高效的治疗方法和药物是鼻咽癌临床治疗过程中迫切需要解决的问题。中医药在治疗肿瘤时具有药源丰富、组方灵活、毒副作用小、安全性高等优势，且中药可作用于多途径、多靶点，从而产生更加有效和持久的治疗效果。因此，从传统中药中寻找抗肿瘤的活性成分，将其组合发挥药物的协同作用，进而研究其作用机制，已成为当前抗肿瘤药物的研究热点之一。

Fig 10 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 of related proteins expression n=3)

“气虚染毒”是NPC的中医病因病机，益气解毒是其治疗原则之一[2-3]。黄连性寒味苦，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿，泻火解毒等功效；人参性温、平，味甘、微苦，归脾、肺经、心经，乃“滋补养生、扶正固本”之极品；两者联用具有益气解毒之效，是中医临床上治疗肿瘤的方剂中使用频次较高的中药。近年来发现黄连的主要活性成分小檗碱能通过抑制SP1、EMT的表达提高鼻咽癌放疗敏感性[12]；通过EB病毒核抗原1依赖性机制和抑制肿瘤相关成纤维诱导的STAT3的活化来抑制鼻咽癌细胞的增殖和成瘤能力[13-14]。人参的活性成分人参皂苷Rg3可增强鼻咽癌放疗患者外周血淋巴细胞免疫功能，减轻放疗毒副作用,还可通过抑制EMT抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移[15-16]。这些提示小檗碱与人参皂苷Rg3可作为治疗NPC的潜在药物，但关于两者联用效果是否更佳的研究相对较少。我们前期研究发现小檗碱联合人参皂苷Rg3可能通过MAPK/ERK信号通路发挥协同抗鼻咽癌的作用[7]，而相对于以单一的信号通路为靶点，药物同时作用于2条或2条以上的通路抗肿瘤效果更佳。小檗碱与人参皂苷Rg3的协同作用是否还涉及其他的信号通路仍需进一步探究。

PI3K/Akt信号通路在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和自噬中具有重要的调控作用[8]。前期文献报道小檗碱和人参皂苷Rg3单用均能下调PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达[6,17]。因此，我们推测小檗碱联合人参皂苷Rg3可能通过抑制PI3K/Akt信号通路、调控凋亡相关蛋白的表达，最终达到协同抗鼻咽癌的作用。本研究中我们发现：与单独用药组相比，联合用药组细胞的PI3K/Akt信号通路关键蛋白PI3K p110α和p-Akt的表达明显下调(P<0.05)。提示小檗碱联合人参皂苷Rg3能够抑制PI3K/Akt信号通路的活化。进一步研究发现PI3K/Akt信号通路激活后(p-Akt表达上升)，小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制CNE2细胞增殖和诱导细胞凋亡的效应降低，Survivin、PCNA及Bcl-2表达量增加，Bax的表达下降。说明PI3K/Akt信号通路的激活剂可减弱小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制鼻咽癌细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，进一步证实了小檗碱与人参皂苷Rg3联用后还可通过下调PI3K/Akt通路关键蛋白p-Akt的表达，影响增殖、凋亡相关蛋白的表达，从而抑制CNE2细胞增殖、诱导细胞凋亡。

综上所述，本实验我们证实了小檗碱与人参皂苷Rg3的协同作用，并且发现其可通过下调PI3K/Akt信号通路关键蛋白PI3K110α、p-Akt的表达，从而促进Bax的表达、抑制Survivin、PCNA和Bcl-2的表达，最终诱导鼻咽癌CNE2细胞凋亡，抑制细胞增殖。后期实验中我们将进一步验证PI3K/AKT和MAPK/ERK 两条信号通路是否在药物协同抗鼻咽癌过程中存在交互作用。这些研究有助于我们阐明小檗碱联合人参皂苷Rg3治疗鼻咽癌的分子机制，可为其治疗鼻咽癌的临床应用提供实验依据，也可为益气解毒类中药治疗鼻咽癌的现代开发应用提供新方向。