lncRNA HOXA11-AS对膀胱尿路上皮癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究①

夏儒锐 梁培育 王声兴 欧善际 彭晓晖

(海南医学院第一附属医院泌尿外科，海口 570102)

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，以膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)最为常见，其易复发和转移性及术后并发症导致患者生存质量降低，患者5年生存率低于15%[1]。研究其发展的分子机制对疾病的靶向治疗极其重要。研究表明，lncRNA和miRNA在可作为预测BUC患者生存和预后的独立标志物[2-3]。有报道，lncRNA HOXA11-AS(homeobox A11-antisense RNA)在肝癌组织、骨肉瘤组织和细胞及口腔鳞状细胞癌组织中高表达，其过表达可促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖，抑制其表达可抑制肝癌和骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力[4-6]。本研究通过生物信息学预测，发现miR-515-5p可能是lncRNA HOXA11-AS的靶基因。MiR-515-5p在前列腺癌、非小细胞肺癌和胃癌细胞中表达下调，过表达miR-515-5p可抑制癌细胞的增殖或转移[7-9]。但lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表达、对癌细胞的影响及两者的关系目前还尚未可知。本研究探寻HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC细胞增殖、迁移、侵袭中的作用机制，以期为BUC的诊断治疗提供新的分子生物学靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 选取2016年6月至2017年12月于本院病理检查确诊为BUC的患者手术切除的BUC组织及癌旁组织(距离BUC组织边缘>1.5 cm)各20例，男16例，女4例，年龄26～80岁，平均年龄(49.5±16.6)岁，按照2006年WHO标准分类，浸润性14例，非浸润型6例。所有患者术前未接受放疗和化疗。本研究通过医院医学伦理委员会批准，并与所有患者签订知情同意书。

1.1.2试剂及仪器 人BUC细胞株J82购自ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和MEM培养基购自美国Gibco公司，Total RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin购自美国Sigma-Aldrich公司；Cyclin D1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14和GAPDH抗体购自美国Santa公司；lncRNA HOAX11-AS抑制剂(si-HOAX11-AS)、HOAX11-AS过表达载体(pcDNA-HOXA11-AS)、miR-515-5p模拟物(miR-515-5p)、miR-515-5p模拟物(miR-515-5p)、阴性对照(si-NC、pcDNA、anti-miR-NC和miR-NC)和HOXA11-AS野生型(WT-HOXA11-AS)、突变型(MUT-HOXA11-AS)双荧光素酶载体购自苏州吉玛基因公司；Transwell板购自美国Corning公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；光学显微镜、全自动酶标仪、发光仪及RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将J82细胞培养在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的MEM培养液中，培养条件：湿度95%，37℃，5%CO2培养箱中培养。传代保存。

1.2.2细胞转染 转染前24 h，收集对数生长期的J82细胞，胰蛋白酶消化，将细胞稀释为1×106个/ml，以2×105个/孔接种于6孔板，培养至融合度达到80%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。转染分组：HOXA11-AS干扰组(转染si-NC和si-HOXA11-AS)；miR-515-5p过表达组(转染miR-NC和miR-515-5p)；HOXA11-AS过表达组(转染pcDNA和pcDNA-HOXA11-AS)；miR-515-5p和HOXA11-AS双抑制组(共转染si-HOXA11-AS+anti-miR-NC、si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p)，双荧光素酶报告系统组(共转染miR-NC+WT-HOXA11-AS、miR-515-5p+WT-HOXA11-AS、miR-NC+MUT-HOXA11-AS和miR-515-5p+MUT-HOXA11-AS)。转染48 h，收集细胞进行后续实验。

1.2.3qRT-PCR检测miR-515-5p和lncRNA HOXA11-AS的表达 用总RNA提取试剂盒从BUC组织、癌旁组织和培养的J82细胞中提取总RNA，然后反转录试剂盒合成cDNA，合成的cDNA检测后于-80℃保存。取cDNA按照qRT-PCR的说明书进行反应合成lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p，反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 44 s、72℃ 30 s，45个循环；72℃延伸10 min。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4MTT实验测定细胞增殖 转染48 h后，胰蛋白酶消化J82细胞，离心后培养基重悬细胞，将细胞稀释浓度为1×105个/ml，以200 μl/孔接种于96孔板，继续培养，分别在培养至24 h、48 h和72 h时，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，弃上清培养液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。

1.2.5Transwell实验测定细胞迁移和侵袭 迁移实验：收集转染后各组J82细胞，用不含FBS的MEM培养基过夜饥饿培养，用胰蛋白酶消化细胞，用无血清培养基稀释细胞为1×105个/ml。在Transwell下层培养孔加入500 μl含10%FBS的MEM培养基作为迁移趋化物，Transwell上层小室加入100 μl稀释的J82细胞，再将上层小室放入下层培养孔中，置 CO2培养箱培养24 h，用棉签拭去上层小室未迁移的细胞，甲醛固定迁移细胞，结晶紫染色，显微镜观察计数迁移细胞。侵袭实验：用4℃无血清培养基1∶8比例稀释液化的Matrigel，取100 μl加入上层Transwell小室，固化，以下步骤同迁移实验。

1.2.6双荧光素酶报告系统实验 根据1.2.2进行J82细胞培养和转染，将构建的含HOXA11-AS和miR-515-5p结合位点的WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC或miR-515-5p共转染J82细胞，转染后培养48 h，收集并裂解细胞，离心收集上清，-20℃保存或根据试剂盒说明书进行操作，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.2.7Western blot检测蛋白表达 收集各组转染的J82细胞，RIPA裂解液裂解细胞，将细胞进行破碎，收集蛋白，并进行SDS-PAGE，分离蛋白，转PVDF膜，室温封闭2 h，洗膜，加入稀释的一抗(Cyclin D1抗体1∶2 000、p21抗体1∶2 000、p27抗体1∶1 000、MMP-2抗体1∶1 000、MMP-9抗体1∶1 000、MMP-14抗体1∶2 000和GAPDH抗体1∶3 000)，4℃过夜孵育，洗膜，加入稀释的酶标二抗，洗膜，显影，以为GAPDH内参照，计算蛋白水平。

2 结果

2.1lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表达 结果表明，与正常癌旁组织相比，BUC中HOXA11-AS含量显著升高(P<0.05)，miR-515-5p的含量显著下降(P<0.05)，见表1。

2.2干扰HOXA11-AS表达可抑制膀胱尿路上皮癌J82细胞增殖 转染后，与si-NC组相比，si-HOX-A11-AS组的J82细胞中HOXA11-AS水平显著下降(P<0.05)，si-HOXA11-AS组的细胞OD值在48 h、72 h均显著下降(P<0.05)，Cyclin D1表达下降(P<0.05)，p21和p27表达升高(P<0.05)，见图1和表2。说明干扰HOXA11-AS表达可以抑制J82细胞增殖。

2.3干扰HOXA11-AS表达可抑制膀胱尿路上皮癌J82细胞迁移、侵袭 与si-NC组相比，si-HOXA11-AS组J82细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均显著下降(P<0.05)，MMP-2、MMP-9和MMP-14含量显著降低(P<0.05)，见图2和表3。

2.4miR-515-5p过表达可抑制J82细胞增殖、迁移、侵袭 转染后，与miR-NC组相比，miR-515-5p组的miR-515-5p水平显著上升(P<0.05)，J82细胞OD值在48 h和72 h时均显著降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数也显著下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表达降低(P<0.05)，p21表达升高(P<0.05)，见图3和表4。

表1 HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC和癌旁组织中的表达

图1 增殖相关蛋白表达Fig.1 Expression of proliferation-related proteins

表2 干扰HOXA11-AS表达对J82细胞增殖的影响

图2 干扰HOXA11-AS表达对J82细胞迁移、侵袭的影响

图3 miR-515-5p过表达对J82细胞增殖、迁移侵袭的影响

表3 抑制HOXA11-AS表达对J82细胞迁移、侵袭的影响

表4 miR-515-5p过表达对J82细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图4 HOXA11-AS的序列中含有与miR-515-5p互补的核苷酸序列Fig.4 Sequence of HOXA11-AS contains complementary nucleotide sequences with miR-515-5p

2.5lncRNA HOXA11-AS靶向调控miR-515-5p的表达 Targetscan预测发现，miR-515-5p的序列中含有与HOXA11-AS互补的序列，见图4。双荧光素酶报告系统结果如表5所示，与miR-NC对照组相比，miR-515-5p组野生型WT-HOXA11-AS的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)；而突变型MUT-HOXA11-AS的萤火虫荧光素酶相对活性无显著性差异。qRT-PCR结果表明，与pcDNA组相比，pcDNA-HOXA11-AS组的miR-515-5p含量显著下降(P<0.05)；与si-NC组相比，si-HOXA11-AS组的miR-515-5p水平显著上升(P<0.05)。说明HOXA11-AS靶向负调控miR-515-5p的表达，见表6。

表5 双荧光素酶报告实验

表6 lncRNA HOXA11-AS调控miR-515-5p的表达

图5 抑制miR-515-5p表达逆转干扰HOXA11-AS表达对膀胱尿路上皮癌J82细胞增殖、迁移侵袭的作用

表7 抑制miR-515-5p表达逆转干扰HOXA11-AS表达对J82细胞增殖、迁移、侵袭的作用

2.6抑制miR-515-5p表达逆转干扰HOXA11-AS表达对J82细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与si-NC组相比，si-HOXA11-AS组J82细胞中miR-515-5p含量显著升高(P<0.05)，细胞OD值在48 h和72 h时显著下降(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表达降低(P<0.05)，p21表达升高(P<0.05)；与si-HOXA11-AS+anti-miR-NC相比，si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p组J82细胞结果相反，见图5、表7。说明抑制miR-515-5p表达逆转干扰HOXA11-AS表达对J82细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

3 讨论

HOXA11-AS是一种新发现的致癌lncRNA，在多种肿瘤中表达上调，是一种可预测恶性肿瘤转移和预后的潜在生物标志物[10]。 HOXA11-AS在胃癌组织中表达上调，在体内敲除HOXA11-AS可诱导胃癌细胞G0/G1期阻滞，抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和转移[11]。HOXA11-AS在乳腺癌组织中高表达，通过影响EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达，干扰其表达可抑制癌细胞侵袭和迁移[12]。HOXA11-AS在胶质瘤组织和细胞中表达升高，通过调控miR-214-3p/EZH2轴促进胶质瘤细胞生长和转移[13]。但其在BUC中的表达还不清楚。本研究发现，与正常癌旁组织相比，HOXA11-AS在BUC组织中表达量显著升高，干扰HOXA11-AS表达可抑制膀胱尿路上皮癌J82细胞增殖、迁移、侵袭。HOXA11-AS在多种癌症包括BUC中表达上调，并调控癌细胞增殖、迁移和侵袭[10]。

本研究通过Targetscan预测发现，lncRNA HOXA11-AS序列中含有与miR-515-5p互补的核苷酸序列，预示miR-515-5p可能是HOXA11-AS的靶基因。miR-515-5p在前列腺癌、非小细胞肺癌和胃癌中表达下调，与癌细胞的增殖和转移有关[7-9]。miR-515-5p在乳腺癌组织中表达下调，与IGF-1R的单核苷酸多态性影响BRCA1突变携带者的乳腺癌风险[14]。miR-515-5p高表达与乳腺癌和肺癌患者生存率增加有关，通过miR-515-5p/MARK4途径调控癌细胞的迁移和侵袭[15]。miR-515-5p在BUC中的表达尚不清楚。本研究结果发现，miR-515-5p在BUC组织中水平降低，过表达miR-515-5p可抑制J82细胞增殖、迁移、侵袭。说明miR-515-5p在BUC进展中发挥重要作用。

而双荧光素酶报告系统和qRT-PCR结果显示，HOXA11-AS靶向负调控miR-515-5p的表达；抑制miR-515-5p表达逆转了干扰HOXA11-AS表达对J82细胞增殖、迁移、侵袭的作用，进一步证实了在BUC中两者的调控关系。综上，本研究阐述了在BUC细胞J82中，lncRNA HOXA11-AS靶向miR-515-5p调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究只进行了体外细胞的研究，后续研究会从体内动物模型试验着手，以期为BUC的临床研究提供更多的数据支持，以期发现新的靶点。