红景天苷抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结直肠癌细胞凋亡和自噬①

闫圣玉 谢亚锋 刘 英 许志杰 丁雅婷 张 侨 刘菀莹

(南华大学附属第二医院肛肠科,衡阳 421001)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康，其发病率和死亡率在世界范围内均不断上升[1-2]。尽管放化疗的应用可以提高保肛率，但外科手术切除仍然是直肠癌主要的治疗手段[3]。随着人们对CRC认识的深入，有关其相关信号通路对肿瘤细胞发生发展的影响受到广泛重视，为CRC的治疗提供了新的思路和方法。

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)传导通路是一条与细胞分化、存活、增殖、血管生成、新陈代谢等密切相关的信号转导途径，该通道的过表达常出现在人类恶性肿瘤中，被认为是癌症的主调节器[4]。有研究表明，PI3K 信号通路影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内起抑制凋亡、促进增殖的作用，因此靶向 PI3K 途径作为治疗策略成为肿瘤研究的热点。

红景天为景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物，具有极强的适应能力及重要的开发价值，被誉为“高原人参”。红景天苷的化学名称为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是红景天的主要活性成分，其药理作用多种多样，应用前景十分广阔，具有抗肿瘤及增强免疫的功能，其对中枢神经系统、心血管系统、肝肾、抗缺氧的作用也备受关注[5]。但目前尚未见到红景天苷对人CRC治疗的研究报道，本研究通过观察红景天苷对人CRCHT29细胞增殖、凋亡、自噬的影响，研究PI3K/Akt/mTOR通路的调控作用，为CRC的治疗提供新的思路，具有一定价值。

1 材料与方法

1.1材料 HT29细胞购自中国科学院细胞库；红景天苷(北京索莱宝生命科学公司，批号：18052106)；Hoechst 33342(美国Sigma-Aldrich公司，批号L7543)；吖啶橙染色试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司，LY294002)；胎牛血清(Biochrom公司)；P13K(1∶500)、p-P13K(1∶250)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶250)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶500)抗体(Cell Signaling Technology)；LC3抗体(上海赛信通生物试剂有限公司)；GAPDH抗体(碧云天生物技术有限公司)；凝胶成像分析系统(Bio-Rad，型号：Chemi DocXRS+)；荧光显微镜(BX51，Qlympus)。

1.2方法

1.2.1HT29细胞传代培养 HT29细胞培养于含10%牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中常规培养，细胞融合至70%～80%时，0.25%胰酶消化传代继续培养。红景天苷用细胞培养基稀释并调节其终浓度为0.5、1.0、2.0 mmol/L。

1.2.2MTT法检测红景天苷对HT29细胞增殖的影响 取对数生长期HT29细胞，经0.25%胰酶消化后，调整细胞数为1×104个/ml，接种于96 孔板，100 μl/孔，置于37℃，CO2培养箱中孵育24 h。加入终浓度分别为0.5、1.0、2.0 mmol/L的红景天苷设为红景天苷组，并设不加药物的空白对照组，各浓度设4个复孔。分别于培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入 MTT溶液(0.5 mg/ml)100 μl，继续培养4 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜 200 μl，振荡10 min使蓝紫色甲臜溶解，酶标仪测定550 nm波长处各孔光吸收度(OD)，计算细胞活性(以空白孔为对照，酶标仪读取各孔OD值，OD值越高代表细胞增殖能力越强。)

1.2.3赫斯特染色检测HT29细胞凋亡 将HT29细胞接种于24孔板，经不同浓度的红景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，4%多聚甲醛固定，每孔加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，PBS清洗，封片后荧光显微镜下观察。凋亡细胞指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4红景天苷对HT29细胞LC3荧光强度的影响 将HT29细胞接种于24孔板(1×105个/孔)，经不同浓度的红景天苷(1.0、2.0 mmol/L)处理后，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min。用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭处理60 min，滴加LC3抗体，4℃孵育过夜。滴加FITC标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h(避光)。加入适量 Hoechst33342染色10 min，封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5吖啶橙染色观察HT29细胞内酸性囊泡细胞器的累积 细胞于6孔板中爬片培养，经不同浓度的红景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，将吖啶橙(1 μg/ml)缓慢滴加至待测细胞，避光室温染色5 min，吸除染液，PBS漂洗，每孔加适量4%多聚甲醛固定，封片后，倒置荧光显微镜下观察并拍照存档。

1.2.6Western blot检测红景天苷对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 取对数生长期的 HT29 细胞，采用RIPA细胞裂解液于冰浴上提取总蛋白，BCA法定量，加入loadding buffer煮沸10 min。取等量蛋白上样，行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗4℃孵育过夜后， TBST洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)室温孵育2 h，TBST 缓冲液洗涤，ECL发光显影，凝胶成像系统拍照。

2 结果

2.1MTT检测红景天苷对HT29细胞增殖的影响 与对照组相比，红景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)处理48 h、72 h后均能显著抑制HT29细胞活力(P<0.01或P<0.001)，而红景天苷作用24 h无明显抑制作用(P>0.05)，见图1。

2.2赫斯特染色检测HT29细胞凋亡 经1.0、2.0 mmol/L 红景天苷处理48 h后，HT29细胞染色质凝聚、固缩，凋亡形成。与对照组相比，红景天苷组(1.0、2.0 mmol/L)凋亡细胞数明显增加(P<0.01)，见图2。

2.3免疫荧光染色法检测红景天苷诱导HT29细胞自噬 对照组HT29细胞质显LC3绿色荧光但染色较弱，且呈弥散状，而红景天苷组LC3染色强度增强，见图3。

2.4吖啶橙染色观察红景天苷诱导HT29细胞内酸性囊泡细胞器的累积 对照组中只有少量红色荧光，不同浓度红景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用于HT29细胞后，随着浓度增加，被吖啶橙着色显红色的酸性囊泡细胞器增加。

2.5Western blot检测红景天苷对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 对照组HT29细胞中p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达较高，而各剂量红景天苷可均抑制HT29细胞内p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达，其中1.0、2.0 mmol/L红景天苷组p-P13K表达较对照组下降,抑制效果明显(P<0.05)； 2.0 mmol/L红景天苷组p-Akt表达较对照组下降(P<0.05)；0.5、1.0、2.0 mmol/L红景天苷组p-mTOR表达较对照组均下降(P<0.01)，见图5。

图1 不同浓度红景天苷对HT29细胞增殖的影响Fig.1 Effects of salidroside at different concentrations on proliferation of HT29 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

图2 赫斯特染色检测红景天苷对HT29细胞凋亡的影响

图3 红景天苷诱导自噬泡的形成Fig.3 Formation of autophagic vesicles induced by Salidroside

图4 红景天苷诱导HT29细胞内酸性囊泡细胞器的累积Fig.4 Accumulation of acidic vesicle organelles in HT29 cells induced by Salidroside

图5 红景天苷对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响Fig.5 Effect of salidroside on PI3K/AKT/mTOR signal-ing pathwayNote:Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 讨论

自噬即细胞的自我吞噬，是细胞内的重要降解机制，由膜包囊泡包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质进行降解。自噬作为细胞内降解过程，对维持细胞内环境和保证细胞生存至关重要。细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，肿瘤细胞的重要特征之一是由于细胞凋亡通路受阻而导致的无限增殖。研究发现，肿瘤的发生发展需要微环境的支持与保护，自噬和细胞凋亡在结肠癌的复发和转移中起关键作用，PI3K/Akt/mTOR通路能调控肿瘤细胞自噬及凋亡信号传导，使肿瘤细胞发生程序性死亡，其还可抑制肿瘤细胞增殖，对控制结肠癌发生发展产生重要影响[6-7]。

中药红景天的药用价值很高，现代药理学研究证明其具有活血化瘀、抗心肌缺血的作用，在治疗妇女白带、咳嗽、肺热、咯血及咳血等方面疗效显著[8]。红景天苷作为红景天的主要有效成分之一，药理学研究证明其具有抗氧化、免疫调节、心血管保护、抗衰老、肝脏保护、神经细胞保护及影响物质代谢等多种作用[9]。据报道，红景天苷能抑制多种肿瘤细胞生长，如肝癌SMMC-7721细胞和QGY-7703细胞等[10]。

MTT检测发现，红景天苷作用24 h后对细胞无明显抑制作用(P>0.05)，而经红景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)作用48、72 h后与对照组相比均能显著抑制HT29细胞活力(P<0.05)，提示红景天苷能有效抑制人CRC HT29细胞增殖；赫斯特染色发现，经1.0、2.0 mmol/L红景天苷处理48 h后，红景天苷组凋亡细胞数较对照组明显增加(P<0.05)，提示红景天苷具有促进人CRC HT29细胞凋亡作用。

LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，被视为自噬体形成的特殊标志，定位于自噬小体膜，参与自噬过程[11]。自噬发生时，LC3由Ⅰ型转化为Ⅱ型，且LC3表达上调。免疫荧光染色发现，红景天苷组HT29细胞中LC3绿色荧光染色强度较对照组增加，提示红景天苷治疗可促进LC3自噬泡的形成；吖啶橙染色发现，随着红景天苷浓度增加，吖啶橙着色的酸性囊泡细胞器红色增强，而对照组仅显弱红色，提示红景天苷能促进细胞自噬，与LC3免疫荧光染色结果基本一致，可能与其抗肿瘤作用相关。

PI3K/Akt/mTOR通路是一条经典的抑自噬、促存活的信号转导通路，在恶性肿瘤的发生、发展、治疗及转归中发挥重要作用[12]。细胞内活化的 PI3K是一种广泛存在于胞质内的磷脂酰肌醇激酶，能促进PIP2转化为PIP3，激活下游信号分子Akt，进而激活其下游的mTOR，磷酸化的mTOR能通过清除泛素蛋白抑制自噬发生，还能使细胞周期素上调而加速细胞周期[13]；PI3K/Akt/ mTOR还是与细胞凋亡关系最密切的信号传导通路之一，能通过抑制各种癌细胞的凋亡促进细胞生长[14-15]。Akt是一种抗凋亡信号分子，其在PI3K调控下激活，经多种途径调控细胞凋亡[16-17]。因此，通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制Akt活性可激活细胞凋亡。Western blot结果显示，不同浓度红景天苷均可显著抑制p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达(P<0.05)。提示红景天苷可抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化，激活TH29细胞自噬反应，同时提高自噬流导致自噬反应过度，进一步促进HT29细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞损伤，抑制肿瘤。

综上所述，细胞自噬和凋亡在CRC的发生发展中发挥重要作用，红景天苷通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，一方面诱导人CRC细胞HT29凋亡，另一方面促进其发生自噬性死亡从而发挥抗肿瘤作用。因此，课题组将进一步探究红景天苷对CRC细胞的抑制效应，以期为临床治疗提供支持。