重楼皂苷Ⅰ抗肝癌细胞作用的初步研究①

喻青青 樊 旭 朱 敏 郗雪艳 杜伯雨

(湖北医药学院，十堰 442000)

肝癌的发病率不断增加，肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSCs)理论为肝癌的治疗提供了新的思路[1]。CSCs有肿瘤样特征，能够维持其自我更新和分化的能力[2]。肝癌中也存在肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)[3]。因此，CSCs的特异性靶向治疗对根除肿瘤和预防肝癌发生具有重要意义。

目前从中草药中寻找天然抗肿瘤活性成分是抗癌药物研究的一个重要途径和研究热点[4]。重楼现有药理研究表明，重楼具有抗肿瘤活性作用[5]。本文应用重楼有效成分重楼皂苷Ⅰ，通过体外细胞实验，观察其对肝癌细胞Huh7和HepG2的抑制作用，初步探究其是否具有抑制肝癌干细胞的作用。

1 材料与方法

1.1材料 HepG2细胞 和Huh7细胞购自中国医学科研学院基础医学研究所。重楼皂苷Ⅰ(纯度98%)购自上海源叶生物科技有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购自 Gibco公司。

1.2方法

1.2.1细胞及药物处理 人肝癌细胞Huh7和HepG2分别培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞融合为90%时进行传代培养，不同浓度重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞Huh7和HepG2。处理方法如下：①重楼皂苷Ⅰ(3.12 、6.25、12.50 μmol/L)处理肝癌细胞Huh7；②重楼皂苷Ⅰ(6.25、12.50、25 μmol/L)处理肝癌细胞HepG2，处理时间为24 h。

1.2.2MTT法检测细胞活力 选取80%～90%生长密度且状态良好的对数生长期的肝癌细胞Huh7和HepG2制成1×104个/ml的细胞悬液，向96孔板中接种100 μl上述细胞悬液，对照孔用添加DMSO的培养液制成的细胞悬液，每个浓度接种6个孔。培养24 h后弃去培养液，实验组加入不同浓度重楼皂苷Ⅰ(1.56、3.12、6.25、12.50、25、50 μmol/L)继续培养24 h。移除培养液，向孔板中加入100 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后弃上清，加入150 μl DMSO 振荡6 min，溶解结晶物后570 nm处检测吸光值，计算抑制率。抑制率%= (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3Transwell实验检测细胞迁移能力 取对数期肝癌细胞Huh7和HepG2，继续培养24 h后收集细胞，以无血清DMEM培养基重悬细胞，调整浓度为1×106个/ml。向Transwell小室上部培养室内加入200 μl细胞悬液，向底部培养室加入650 μl含10%FBS的RPMI1640完全培养基，每组设3个复孔，在37 ℃、5%CO2下培养24 h。然后，对照组不加药，实验组给予不同浓度的重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，处理时间24 h。吸去嵌室内液体，用棉棒擦去嵌室底部内表面的细胞，以多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS漂洗，于光镜下观察并统计数据。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 取状态良好的对数生长期的肝癌细胞Huh7和HepG2，将计数好的细胞悬液加入6 cm培养皿中，使每皿细胞数为2×105个，在37 ℃、5%CO2培养24 h。然后，对照组不加药，实验组给予不同浓度的重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，处理24 h。收集细胞，用不含EDTA的胰酶消化细胞，用4℃预冷的PBS清洗细胞2次，并用1×结合缓冲液将各组待测细胞制成 1×106个/ml的单细胞悬液，用异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,FITC)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)对细胞进行染色，室温避光孵育15 min，利用流式细胞仪对染色细胞进行检测，实验重复3次。

1.2.5磁珠分选(MACS)分选CD133+/CD133-Huh7和CD133+/CD133-HepG2细胞 取状态良好的对数生长期的肝癌细胞Huh7和HepG2，胰酶消化后加入适量的DMEM液终止消化，收集细胞并计数，使细胞总量达到约1×107个。每1×107个细胞加入80 μl缓冲液重悬，再加入20 μl CD133+微珠，4℃避光孵育30 min后离心去上清液。每1×108个细胞用缓冲液重悬细胞后过柱，分别收集CD133+/CD133--Huh7和CD133+/CD133--HepG2细胞。

1.2.6CD133+及CD133-细胞体外成球实验 将CD133+和CD133-细胞分别以2×103个/孔接种于6孔板中，均给予含生长因子的无血清DMEM/F12培养基(32 μl 25 ng/ml EGF+40 μl 20 ng/ml FGF+800 μl B27+40 ml DMEM/F12)，置于含5%CO2的37℃恒温箱中培养，每隔3 d换液，培养第10天时用倒置显微镜观察阳性及阴性细胞各自生长成球情况。

2 结果

2.1重楼皂苷Ⅰ可抑制肝癌细胞系Huh7和HepG2的活力 MTT法检测细胞存活率分析重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞活力的影响。结果如图1A所示，对于Huh7细胞，当重楼皂苷Ⅰ的浓度大于1.56 μmol/L 时，Huh7细胞的存活率降低到80%以下并且随浓度的增加而降低。图1B显示，对于HepG2细胞，当重楼皂苷Ⅰ的浓度大于3.12 μmol/L时，HepG2细胞的存活率降低到80%以下并且随浓度的增加而降低。

2.2重楼皂苷Ⅰ可抑制Huh7和HepG2的迁移能力 Transwell实验结果：图2A和图2B均显示，重楼皂苷Ⅰ剂量组，随着重楼皂苷Ⅰ浓度的增加，穿膜细胞数量逐渐下降并低于对照组。

2.3重楼皂苷Ⅰ可诱导肝癌细胞凋亡 图3A显示，与空白对照组比较，重楼皂苷Ⅰ干预Huh7细胞24 h后，随着给药剂量的增加，活细胞数量明显降低，凋亡细胞数量明显增多，凋亡率从(22.32±4.83)%增加到(46.86±4.53)%，表明重楼皂苷Ⅰ诱导Huh7细胞发生凋亡。图3B显示，重楼皂苷Ⅰ作用HepG2细胞24 h后，6.25 μmol/L组细胞凋亡率为(17.27±4.35)%，12.50 μmol/L组细胞凋亡率为(27.52±6.65) %，25 μmol/L细胞凋亡率为(43.76±6.77)%，均明显高于对照组(0.67±0.07)%。说明重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用存在浓度依赖性。

图1 重楼皂苷Ⅰ对Huh7和HepG2细胞活力的影响Fig.1 Effect of Polyphyllin Ⅰ on cell viability in Huh7 cells and HepG2 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group.

图2 Transwell小室细胞迁移实验检测重楼皂苷Ⅰ对Huh7细胞和HepG2细胞迁移能力的影响(×20)Fig.2 Influence of PolyphyllinⅠ on migration ability of Huh7 cells and HepG2 cells by Transwel1 cel1 migratioll assay(×20)

2.4重楼皂苷Ⅰ对肝癌干细胞的影响 细胞培养至第8天时，CD133+细胞组培养基中大量悬浮细胞逐渐聚集成团呈立体球状，而CD133-细胞在相同条件下球状相对较小。给予含CD133+、CD133-的Huh7细胞6.25μmol/L重楼皂苷Ⅰ处理24 h，给予含CD133+、CD133-的HepG2细胞12.5 μmol/L重楼皂苷Ⅰ处理24 h，发现含CD133+、CD133-的Huh7细胞和HepG2细胞的细胞团的形态都发生同样的变化，细胞团溶解，逐渐变小，细胞形态发生皱缩。如图4。

图3 流式细胞术观察重楼皂苷Ⅰ对Huh7细胞和HepG2细胞凋亡的影响Fig.3 Detection of apoptosis in Huh7 cells and HepG2 cells were tread with different concentrations of PolyphyllinⅠby flow cytometric analysisNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group.

图4 重楼皂苷Ⅰ对肝癌肿瘤干细胞的影响(×10)Fig.4 Effects of Polyphyllin I on stem cell balls of Huh7 cells and HepG2 cells(×10)

3 讨论

几乎所有的恶性肿瘤中都潜伏着极少的CSCs，是癌症产生、复发、转移乃至放化疗抵抗以及治疗失败的根源[6]。肝癌已成为全球癌症相关死亡的第二大原因，每年新增肝癌患者30万～100万例[7]。肝癌中也存在LCSCs，寻找LCSCs特异性靶点以及针对LCSCs的诊断及治疗，将会为肝癌的预防、早期诊断、有效治疗、预后监测以及彻底治愈肝癌开辟一条崭新的途径[8]。

植物类抗肿瘤药物是目前的研究热点，重楼是其中之一[9-11]。重楼皂苷Ⅰ为重楼的主要有效成分，一些研究表明，重楼皂苷Ⅰ对卵巢癌、胃癌、骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌等具有抗肿瘤的作用[12-17]。目前重楼皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用还不清楚，因此，本文选取了肝癌细胞株Huh7细胞和HepG2细胞为研究对象，旨在研究重楼皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用[18-23]。

MTT结果显示，重楼皂苷Ⅰ在体外对肝癌细胞株Huh7细胞和HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，并且随着药物浓度的增加，抑制作用愈加明显。MTT实验结果表明，重楼皂苷Ⅰ作用于Huh7细胞时，当浓度为6.25 μmol/L时，其抑制率为59%；重楼皂苷Ⅰ作用于HepG2细胞时，当浓度为12.50 μmol/L，其抑制率45%；因此选取了不同给药浓度进行后续实验。

目前治疗肿瘤广泛采用的策略主要是诱导肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖，是治疗肿瘤药物的重要作用机制之一[24-26]。通过Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测可见重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞细胞株诱导凋亡作用。重楼皂苷Ⅰ作用Huh7细胞24 h，细胞凋亡率随浓度增加而增加；重楼皂苷Ⅰ作用HepG2细胞24 h后，对细胞的凋亡诱导存在浓度依赖性。

肿瘤细胞在转移的过程中最为关键的步骤就是肿瘤细胞的迁移[27]，它是导致患者死亡的重要原因之一。通过Transwell实验结果显示：在Huh7细胞及HepG2细胞中重楼皂苷Ⅰ剂量与对照组比较，随着浓度的增加，穿膜细胞数量逐渐下降，因此，重楼皂苷Ⅰ能抑制肝癌细胞株Huh7和HepG2细胞的迁移能力。

目前有多种表面标志物被用来区别LCSCs，例如CDl33[28]。目前CD133+己成为包括肝癌在内的多种实体肿瘤CSCs的标志物[29]。可以采用免疫磁珠分离技术，以CD133为特征性表面标志物来得到LCSCs[30]。结果显示，免疫磁珠分选得到的CD133+-Huh7细胞和CD133+-Huh7细胞对比CD133--HepG2细胞和CD133--HepG2具有更强的体外成球能力，进而采用中浓度的重楼皂苷Ⅰ处理肿瘤细胞球24 h，结果显示CD133+及CD133-的肿瘤细胞球变小，细胞形态发生皱缩。

本研究表明，重楼皂苷Ⅰ抑制肝癌细胞株Huh7细胞和HepG2细胞的增殖，诱导两种细胞的凋亡，降低其迁移能力。但是磁珠分选LCSCs后，通过无血清体外成球实验结果显示，得出结论是重楼皂苷Ⅰ不具备明显的杀伤LCSCs的能力，提示重楼皂苷Ⅰ可能不是通过作用于LCSCs发挥抗肝癌作用，有待进一步研究并探讨重楼皂苷Ⅰ抗肝癌的作用机制，为临床开发新的抗肝癌的药物提供新的思路和基础。