血清LncRNA MEG3、miR-141表达对类风湿性关节炎诊断价值分析

张学平，金钰，邵宏伟，王丹，王静

类风湿性关节炎是一种以关节滑膜炎为主的慢性系统性自身免疫性疾病，临床主要表现为手、足小关节等处多发性关节炎，可导致患者关节疼痛、损坏甚至功能丧失，严重影响患者生活质量[1]。目前临床多采用影像学结合相关标志物对类风湿性关节炎进行诊断和评估，但诊断效能仍较低[2]。 研究表明，长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)在骨性关节炎患者软骨组织中表达量明显降低，与软骨退化程度密切相关[3]。Li等[4]研究发现，强直性脊柱炎患者LncRNA MEG3表达下调，可靶向调控炎性因子表达发挥抗炎作用，可作为治疗靶点。微小RNA-141(miR-141)在骨性关节炎大鼠模型脊髓背角细胞中表达上调，可促进关节疼痛的发生[5]。LncRNA MEG3与miR-141在结直肠癌化疗耐药进展中存在调控关系[6]，但类风湿性关节炎中二者作用关系尚不清楚。现分析类风湿性关节炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平及其与疾病发生发展、预后的关系，并对类风湿性关节炎的诊断和预后进行评估，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年2月—2018年1月鞍钢集团公司总医院风湿免疫科诊治类风湿性关节炎患者191例(病例组)，其中男88例，女103例，年龄27～63(48.13±9.54)岁；病程0.5～4.6(2.37±0.71)年。以病情变化分为活动期98例(活动亚组)，缓解期93例(缓解亚组)。活动亚组男42例，女56例，年龄27～63(47.72±9.15)岁；病程0.5～4.5(2.31±0.64)年；以膝、踝等负重关节肿胀疼痛为首发症状53例，以手、足等外周小关节肿胀疼痛为首发症状45例。缓解亚组男46例，女47例，年龄28～63(48.64±9.79)岁；病程0.5～4.6(2.39±0.73)年；以膝、踝等负重关节肿胀疼痛为首发症状47例，以手、足等外周小关节肿胀疼痛为首发症状46例。另选取同期在医院体检的健康者90例为健康对照组，其中男39例，女51例，年龄27～62(48.06±9.13)岁。3组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准同意，所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①根据美国风湿病学会诊断标准[7]，确诊为类风湿性关节炎；②临床资料完整；③依从性较好。(2)排除标准：①合并其他自身免疫性疾病；②合并高血压、糖尿病及感染性疾病；③患有精神疾病及肝、肾功能严重不足者；④有既往治疗史患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平检测：患者于入院翌日晨、健康者于体检时分别采集空腹外周静脉血5 ml，离心分离血清，于-80℃保存备用。上述血清采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LncRNA MEG3、miR-141表达水平。血清样本在冰上完全解冻后使用RNA提取试剂盒(德国Roche公司生产)提取总RNA。使用反转录试剂盒(加拿大ABM公司生产)对RNA进行反转录，获得cDNA。再使用qRT-PCR试剂盒(德国Roche公司生产)进行qRT-PCR试验，20 μl反应体系如下：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。将反应体系按如下步骤进行反应：95℃ 7 min，1个循环；95℃ 15 s、62℃ 32 s、73℃ 15 s，40个循环，1个样品重复3次。LncRNA MEG3以GAPDH为内参基因，miR-141以U6为内参基因，采用2-△△CT法计算血清LncRNA MEG3、miR-141相对表达水平。试验所用引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，见表1。

1.3.2 血清IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平检测：采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶3(MMP-3) 表达水平，严格按照试剂盒(美国Abcam公司生产)说明书进行操作。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 各组血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平比较 血清LncRNA MEG3表达水平比较，活动亚组<缓解亚组<健康对照组，而miR-141表达水平比较，活动亚组>缓解亚组>健康对照组(P均<0.05)，见表2。

表2 各组受试者血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平比较

2.2 各组血清IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平比较 健康对照组、缓解亚组、活动亚组血清IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平均依次升高，差异均有统计学意义(P均<0.01)，见表3。

表3 各组受试者血清IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平比较

2.3 血清LncRNA MEG3、miR-141表达与炎性因子相关性分析 血清LncRNA MEG3与血清miR-141表达水平呈负相关(r=-0.432，P=0.000)。血清LncRNA MEG3与血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈负相关(P<0.01)，血清miR-141与血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈正相关(P<0.01)，见表4。

表4 血清LncRNA MEG3、miR-141表达与炎性因子相关性

2.4 血清LncRNA MEG3、miR-141诊断类风湿性关节炎效能 利用ROC综合分析血清LncRNA MEG3、miR-141水平诊断类风湿性关节炎的价值。血清LncRNA MEG3诊断类风湿性关节炎的AUC为0.801(95%CI0.744～0.858)，截断值为0.80，其诊断敏感度为78.00%，特异度为72.20%,约登指数为0.502。血清miR-141诊断类风湿性关节炎的AUC为0.822(95%CI0.768～0.875)，截断值为1.84，其诊断敏感度为77.50%，特异度为83.30%,约登指数为0.608。二者联合检测诊断类风湿性关节炎的AUC为0.867(95%CI0.813～ 0.921)，敏感度为89.60%，特异度为79.90%,约登指数为0.695，见图1。

图1 血清LncRNA MEG3、miR-141诊断

2.5 影响类风湿性关节炎发生的危险因素分析 以是否发生类风湿关节炎为因变量，以血清LncRNA MEG3、miR-141、IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平为自变量建立Logistic回归模型。高miR-141、高IL-6、高TNF-α、高MMP-3水平是影响类风湿性关节炎发生的危险因素，而高LncRNA MEG3水平是其发生的保护因素(P<0.01)，见表5。

表5 影响类风湿性关节炎发生的危险因素分析

3 讨 论

类风湿性关节炎患者多表现为手、足、腕、膝关节等部位受累，出现肿胀、畸形、脱位等，若累及其他器官可出现心肌炎、冠状动脉炎、皮肤溃疡、间质性肾炎等，严重影响患者身心健康[1]。目前类风湿性关节炎的发病机制尚不明确，但多数研究认为，T淋巴细胞及巨噬细胞释放大量炎性细胞因子引起骨关节破坏是类风湿性关节炎发病的主要机制[8]。

LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的转录RNA，可调控机体蛋白质合成，并在疾病进展中发挥重要作用。Chen等[9]研究发现，骨关节炎中LncRNA MEG3表达明显下调，可调控软骨细胞增殖、凋亡、细胞外基质降解和炎性反应。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者血清LncRNA MEG3表达水平明显降低，且活动亚组低于缓解亚组，与LncRNA MEG3在骨关节炎进展中表达趋势一致，提示LncRNA MEG3水平降低可能通过预示炎性反应水平上调和软骨细胞活性增强，反映类风湿性关节炎发生发展进程。LncRNA MEG3可减少炎性细胞因子产生，缓解肺部细菌感染小鼠促炎反应，在脓毒症抗菌免疫进展中有重要作用[10]。Tong等[11]研究报道，糖尿病视网膜病变中高糖可通过抑制LncRNA MEG3表达，促进TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，影响疾病加重。有研究报道，过表达LncRNA MEG3可通过减少TNF-α、IL-6缓解骨关节炎兔模型的疼痛和炎性反应[12-13]。MMP-3是预测类风湿性关节炎患病严重程度及预后的重要生物标志物[14-16]。有研究证实，LncRNA MEG3可通过下调MMP-3来抑制胃癌细胞迁移能力[17]。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者血清LncRNA MEG3与IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平均呈负相关，提示LncRNA MEG3水平降低可能通过升高IL-6、TNF-α、MMP-3等炎性细胞因子水平，促进炎性反应，进而影响类风湿性关节炎发生和病情加重。

miRNA长度约20个核苷酸，能够在各种组织和细胞中稳定存在，可参与机体生理反应和疾病进展。有研究表明，非酒精性脂肪肝炎进展中miR-141高表达，下调其表达可减少肝脂肪变性和炎性反应[18]。股骨头坏死小鼠模型骨组织中miR-141高表达，抑制其表达可改善成骨细胞活性，抑制股骨头坏死进展[19]。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者血清miR-141表达水平明显升高，且活动亚组miR-141表达水平明显较高，提示miR-141表达上调可能通过影响炎性反应和成骨细胞代谢，促进骨关节破坏及类风湿性关节炎发生发展。miR-141在子痫前期患者胎盘组织中高表达，与病理妊娠的免疫调节密切相关[20]。Rajkumar等[21]研究发现，脑卒中后小鼠脑组织中miR-141表达上调，可靶向调控IL-6、TNF-α促进炎性反应增加，导致神经功能缺损加重和梗死面积增加。骨关节炎中TNF-α可诱导MMP-3表达，促进炎性反应和疾病进展[22]。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者血清miR-141与IL-6、TNF-α、MMP-3表达水平均呈正相关，提示miR-141可能通过影响炎性细胞因子表达，促进骨关节损伤发生，导致类风湿性关节炎发生发展。

研究发现，LncRNA MEG3可通过靶向miR-141促进结直肠癌细胞的化疗敏感性[6]。Li等[23]研究表明，类风湿性关节炎患者滑膜细胞中过表达LncRNA MEG3可下调miR-141水平，促进细胞增殖并抑制炎性反应。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者血清LncRNA MEG3与miR-141表达水平呈负相关，提示LncRNA MEG3与miR-141间可能存在相互作用，共同影响类风湿性关节炎进展。本研究还发现，高miR-141水平是影响类风湿性关节炎发生的危险因素，而高LncRNA MEG3水平则是其保护因素，且血清LncRNA MEG3、miR-141水平联合检测诊断类风湿性关节炎的曲线下面积、敏感度及特异度最高，提示血清LncRNA MEG3水平降低、miR-141水平升高可能作为类风湿性关节炎发生的预测指标，临床可通过二者联合诊断，评估类风湿性关节炎发生。

综上所述，类风湿性关节炎患者血清LncRNA MEG3低表达、miR-141高表达，二者间可能存在一定相互作用，通过调控炎性反应，参与类风湿性关节炎发生发展进程。但二者间具体调控机制尚需进一步进行试验探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张学平：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；金钰：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；邵宏伟：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；王丹：进行统计学分析；王静：课题设计，论文撰写