应用微卫星技术比较两个实验小鼠群体遗传结构的差异

光姣娜左 琴魏 杰周佳琪王 洪岳秉飞

(中国食品药品检定研究院,北京 102629)

ddY 小鼠是一种可自发出现多种疾病,具有较高建模成功率的实验小鼠,多种疾病包括肺癌,恶性淋巴瘤,卵巢癌,乳腺癌,以及自发性肾小球肾炎等[1-3]。 其中,ddY 小鼠自发性肾病的症状以及基因位点与肾小球肾炎患者的临床状况十分相似[3]。由于具备其他品系实验小鼠没有的独特优势,ddY小鼠已经成为应用前景良好的实验小鼠。

实验动物封闭群是指在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4 代以上的实验动物种群[4]。 封闭群实验动物的繁育特点有可能导致实验小鼠群体发生遗传漂变,突变或选择,进一步引起群体遗传结构的改变。 遗传结构组成的变化会直接影响实验动物的表现型,直接决定实验结果的准确性、科学性和可比性。 因此,定期对长期封闭繁育的封闭群实验动物群体进行遗传质量监测是非常必要的。

微卫星标记和SNP 标记是广泛应用于大鼠、小鼠、兔、猫、小型猪等多种实验动物的遗传质量检测方法[5-7]。 相较于SNP 技术,微卫星检测技术具有更丰富多态性,并且具有较好的保守性,其可以检测同一群体不同个体之间的遗传差异,以定量的方式精确展现实验动物的遗传状况[8]。 与SNP 相比,采用较少的微卫星位点即可实现对封闭群小鼠的遗传质量检测。

本研究旨在应用微卫星技术监测两个ddY 实验小鼠群体的遗传结构,分析长期封闭繁育对实验动物群体遗传结构的影响,探讨对封闭群实验动物群体进行定期遗传结构监测的必要性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

A 群:本单位2013 年从日本脏器制药有限责任公司引进的ddY 小鼠,已在本单位屏障系统繁育6年。 B 群:本单位2019 年从日本脏器制药有限责任公司引进的ddY 小鼠。 从两个群体中各自随机选取 38 只,雌雄各半,SPF 级,28 ～ 30 g,8 周龄 ddY 小鼠的鼠尾1～2 cm。

ddY 小鼠均于本单位屏障系统中繁育[SCXK(京)2017-0005]。 小鼠取材操作于中国食品药品检定研究院动物实验设施内进行[SYXK(京)2017-0013]。 所有实验操作均符合“3R”原则,经中国食品药品检定研究院动物福利伦理审查委员会审批(中检动(福)第 2019(A)001 号)。

1.2 主要试剂与仪器

100 bp DNA marker(批号:A2601A)和 PCR 反应试剂盒(批号:R007A)均购自TaKaRa 公司;50"TAE Buffer(批号:F521KA1898)购自生工生物工程股份有限公司。

PCR 仪:Veriti 96 well Thermal cycler(美国 ABI公司);电泳仪:Power Pac Basic(美国 Bio-Rad 公司);凝胶成像分析仪:GL 212 Pro(美国Kodak 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA 提取

酚氯仿抽提法提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测其完整性,纯度和浓度。 所有 DNA 样本的 A260/280 均为 1.7 ～1.9,样品纯度合格;DNA 样本稀释到50 ng/μL 作为DNA工作液,-20℃保存备用。

1.3.2 引物的选择

本实验采用的36 个微卫星位点均来自本实验室前期研究成果[9],文献中未注明的6 个微卫星位点引物序列信息详见表1。 由北京擎科新业生物技术有限公司标记正向引物的5’端并合成引物。

表1 6 个微卫星位点引物序列信息Table 1 Primer sequence of six microsatellites loci

1.3.3 PCR 扩增与优化

20 μL PCR 反应体系:H2O 13.8 μL,10× Buffer 2 μL,dNTP Mixture 1 μL,上下游引物各 1 μL,样品DNA 1 μL,Taq 酶 0.2 μL。 PCR 扩增程序:94℃,5 min;94℃,30 s,退火温度,30 s,72℃,30 s,35 个循环;72℃, 7 min。 其中不同引物的退火温度(annealing temperature, Tm)不同。 扩增产物 5 μL与 6× loading Buffer 1 μL 混匀上样,用 2.5%琼脂糖凝胶以200 V,30 min 进行电泳,紫外凝胶成像仪拍照记录。

1.3.4 测序

PCR 扩增结果由北京擎科新业生物技术有限公司进行STR 测序。

1.4 统计学方法

根据STR 测序结果,将数据转换为AA,BB,AB样格式,应用PopGen 1.32 软件分析两个群体的等位基因数、有效等位基因数、期望杂合度、观测杂合度、平均杂合度以及香隆指数。 通过等位基因数和各个等位基因频率在统计软件Littleprogram 0.6 中计算多态性信息含量。 用统计分析软件SPSS 21 作独立样本t检验比较两个群体之间遗传结构参数的差异,结果用平均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 两个群体遗传结构信息中单态性的微卫星位点

选取的36 个微卫星位点均匀分布于小鼠所有染色体。 其中有5 个位点在 A 群和B 群均为单态性位点,另5 个位点在A 群中为单态性位点而在B群中为多态,具体位点名称详见表2。 两个群体中均为单态的微卫星位点,多态性欠佳,在后续遗传结构的分析中不予采纳。

表2 36 个微卫星位点名称和相关信息Table 2 36 microsatellite loci and their related information

2.2 PCR 反应条件退火温度的优化

以初选退火温度(annealing temperature, Tm)对样本进行PCR 扩增,30 个位点得到特异性扩增,6个位点出现非特异扩增条带。 后续优化这6 个位点的退火温度: D5Mit48 (52℃ →57℃), D11Mit4(52℃ →59℃),D13Mit3 (52℃ →57℃),D6Mit8(52℃ →62℃),D15Mit15 (52℃→60℃),D19Mit3(52℃→57℃),使之均扩增出理想条带。 以D6Mit8为例,Tm 值为60℃时凝胶图谱有非特异性扩增条带(图1)。 将 Tm 值分别做 60℃,61℃,62℃梯度,结果发现产物特异性逐渐变好。 图2 是优化后A群38 个样本在D6Mit8 位点上的凝胶图。

2.3 STR 测序结果

STR 测序通过检测DNA 的具体长度,精确区分相差1 bp 的DNA 片段并以不同峰型显示结果[10]。图3 为 A 群 1 号样本扩增产物在 D4Mit235 和D7Mit281 位点上的STR 测序结果。 其中D4Mit235位点上为单峰,属于纯合(图3A);而D7Mit281 位点上则为双峰,属于杂合(图3B)。

注:4:A 群体中4 号样品在Tm 分别为60℃,61℃,62℃时的凝胶图;14:A 群体中14 号样品在Tm 分别为60℃,61℃,62℃时的凝胶图;M:100 bp DNA Marker。图1 不同退火温度条件下的D6Mit8微卫星位点PCR 结果电泳图Note.4,Results of No.4 in group A when Tm was 60℃,61℃ and 62℃, respectively.14, Results of No.14 in group A when Tm was 60℃, 61℃ and 62℃, respectively.M, 100 bp DNA Marker.Figure 1 Electrophoresis of PCR products at site D6Mit8 at different annealing temperatures

2.4 两个实验小鼠群体的遗传结构信息

遗传结构参数可定量的体现实验动物群体的遗传结构组成。 去除2.1 表2 中两个群体均为单态的5 个位点后,利用31 个微卫星位点分析两个群体的遗传结构参数。 表3 和表4 分别是A 群和B 群的遗传结构参数分析结果。 统计分析结果如表5 所示,除有效等位基因数外,两组在其余遗传参数均有显著差异。

3 讨论

本实验应用31 个多态性良好的微卫星位点进行扩增和测序后分析发现,ddY 小鼠两个群体的观测杂合度、期望杂合度、平均杂合度、等位基因数、多态性信息含量、香隆指数均有显著差异。 平均杂合度是反映群体遗传多样性的重要遗传指标,若封闭群杂合度为0.5 ～0.7,则说明封闭群遗传质量良好[11]。 A 群和 B 群平均杂合度分别是 0.338 和0.481。 统计结果显示两组在杂合度方面有显著差异(P<0.01),表明两个群体遗传杂合度均较低,但相较于A 群,B 群ddY 小鼠遗传多样性更丰富。 等位基因数是指同一微卫星位点上不同等位基因的数量[12],等位基因与有效等位基因数越接近,则该群体内的等位基因分布越均匀,遗传一致性越高[12]。 A 群平均等位基因数和平均有效等位基因数分别是2.484 和1.743;B 群平均等位基因数和平均有效等位基因数为3.484 和2.130。 这种等位基因数和有效等位基因数出现偏差的现象在吴盈萍等[12]、万倩倩等[13]关于伊犁鹅的研究中也有出现,可能由封闭群动物的定向选育,群体规模缩小,遗传多样性降低导致。 多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)主要用于评估微卫星位点用于研究群体多态性的价值,是与等位基因数目和等位基因频率相关的直观表现遗传多态性的遗传参数[14],PIC>0.5 表示高度多态,0.25

注:1～38:A 群体ddY 小鼠DNA 样本号;M:100 bp DNA Marker,分子量从大至小依次为500、400、300、200、100 bp。图2 退火温度为62℃时A 群体38 个样本在D6Mit8 微卫星位点上的凝胶图谱Note.1～38, Numbers of ddY mice genomic DNA in group A.M,100 bp DNA marker(500,400,300,200, and 100 bp).Figure 2 Gel map of 38 samples from group A at site D6Mit8 at the annealing temperature of 62℃

微卫星标记,又称短串联重复序列,由2 ～6 bp重复碱基核心序列和侧翼序列组成,微卫星序列的重复碱基通常有数个到数十个拷贝,具有多态性丰富、保守性好、易操作和实用性强[16]等优点,是国际实验动物学会(ICLAS)[17]和实验动物国家标准GB 14923-2010 推荐研究群体遗传结构组成和遗传多样性的重要工具[9,18]。 近年来,美国杰克逊实验室和Charles River 实验室均采用微卫星方法对实验动物质量进行监测,国内也有很多研究者筛选出不同组微卫星位点监测不同品系小鼠,大鼠,兔,小型猪等实验动物以及伊犁鹅,坡鹿等畜牧动物的遗传质量[19-21]。 为使一组微卫星位点尽可能完整体现特定实验动物群体的遗传多样性,我们需对微卫星位点进行筛选和优化。 参考王洪等[9]和 Barker(1994)提出的建议,初步筛选均匀分布于小鼠所有染色体的微卫星位点。 多个群体内均为单态的微卫星位点不能体现群体的遗传多样性,可提供的遗传信息含量很少,属于群体间保守位点,常用于鉴别不同近交系实验动物[22-24]。 本实验旨在分析ddY 小鼠A 群体和B 群体的遗传结构组成及遗传多样性是否有明显差异。 因此,在后续的遗传结构分析中,剔除两个群体均为单态的5 个微卫星位点,保证实验数据的可靠性。

实验中的STR 测序是通过毛细管电泳检测DNA 片段通过激光扫描窗口的实际时间而计算出DNA 片段长度[25]。 非特异性扩增条带会影响STR测序结果甚至导致STR 测序结果出现错误。 在进行STR 测序之前,确保PCR 扩增出特异性良好的条带对实验结果准确性至关重要,而退火温度是PCR扩增结果最主要的影响因子。 本实验通过优化退火条件使PCR 扩增出理想条带,为STR 测序实验结果准确性提供了先决条件。

注:A:D4Mit235 位点;B:D7Mit281 位点;横坐标为DNA 片段长度;纵坐标为波峰高度。图3 D4Mit235 和D7Mit281 位点的STR 测序图谱Note.A, Locus D4Mit235, B, Locus D7Mit281, X-axis is DNA length, Y-axis is peak height.Figure 3 STR sequencing results of locus D4Mit235 and D7Mit281

表3 实验小鼠A 群的遗传结构参数Table 3 Genetic structure parameters of laboratory mice group A

本研究中ddY 实验小鼠两个群体的遗传结构参数存在显著差异。 研究结果表明,经过长期封闭繁育,实验小鼠A 群体的遗传结构已经发生改变。 本单位2019 年引进的ddY 实验小鼠B 群的群体遗传多样性更丰富,更符合封闭群实验动物群体的遗传结构特征。 因此,长期封闭繁育的实验动物群体应定期进行遗传质量监测,保证群体遗传结构的稳定性,从而确保动物实验结果的准确性、重复性和科学性。

表4 实验小鼠B 群的遗传结构参数Table 4 Genetic structure parameters of laboratory mice group B

表5 两个实验小鼠群体遗传结构参数的比较Table 5 Comparison of genetic structure parameters of group A and group B