胍基丁胺通过调节Nrf2/HO-1 信号通路减轻丙泊酚诱导的新生大鼠的神经毒性

张少华张彦芳曹 萌李 燕廖立夏王贝贝

(1.南阳市第一人民医院儿一科,河南南阳 473000; 2.新乡医学院第一附属医院内分泌二病区,河南新乡 453100)

丙泊酚因其起效快,连续输注而无累积和恢复快等特点,已在儿科和产科患者中普遍用作静脉麻醉药和镇静药[1]。 胎儿和新生儿应用丙泊酚可引起短期和长期神经毒性,导致神经变性[2]。丙泊酚会引起剂量依赖的变化,导致新生神经元和胚胎神经干细胞的损伤,并对啮齿动物造成永久性的神经损伤[3-4]。 丙泊酚对婴儿大脑发育的潜在副作用也引起了人们对其安全性的关注,因此开发新的药物来预防丙泊酚的神经元副作用具有重要意义。

胍基丁胺(agmatine)是L-精氨酸在精氨酸脱羧酶作用下的产物,分布于哺乳动物体内所有器官和组织,在中枢神经系统可作为抗抑郁药物,促进记忆的巩固[5],具有抑制肝癌细胞、血管平滑肌细胞、星形胶质细胞等细胞增殖的作用[6]。 相关研究表明,胍基丁胺可在OGD 模型中明显减少神经元死亡,保护缺血神经元,并减少NCAO 模型脑梗死面积[7]。 目前未见关于胍基丁胺对丙泊酚诱导的新生大鼠的神经毒性具体作用机制的相关报道。 本文旨在探讨胍基丁胺对丙泊酚诱导的新生大鼠的神经毒性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60 只无特定病原级 (specefic pathogen free,SPF) 健康雄性SD 大鼠,来源于成都达硕实验动物有限公司[SCXK(川)2019-031],3 周龄,体重(50±3)g,饲养于河南省精神病医院[SYXK(豫)2020-0010]。 常规饲养7 d。 本文研究均经过我院伦理委员会批准(IACUC-20191012-11),符合3R 原则。

1.2 主要试剂

胍基丁胺(S98238)购自上海源叶生物科技有限公司,化学式:C5H14N4,分子量:130.19,纯度≥97%;丙泊酚(100806-201803)购自中国食品药品检定研究院,化学式:C12H18O,分子量:178.27,纯度≥99.9%;TTC 染液(D025-1-3)、苏木素-伊红染液(D006-1-1)购自南京建成生物工程研究所;Nissl 染色液(C0117)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天生物技术研究所;兔抗 BDNF ( ab226843 )、 NGF ( ab6199 )、 Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、Nrf2(ab31163)、p-Nrf2(ab137550)、HO-1(ab13243)单克隆抗体购自英国Abcam 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及分组

将大鼠随机分为 5 组:Control 组、Propofol 组、Propofol + Agmatine 1.25 mg/kg 组、 Propofol +Agmatine 2.5 mg/kg 组和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 组。 参照 Xiao 等[8]方法对除 Control 组外各组腹腔注射丙泊酚50 mg/kg 诱导神经毒性损伤,Control组腹腔注射等量生理盐水。 当前期进行预实验给药时,给药剂量低于或等于5 mg/kg 时,均未出现明显毒性作用,因此选择给药剂量5 mg/kg 为最高给药剂量,倍数递减剂量确定给药梯度为:5、2.5、1.25 mg/kg。 Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg 组、Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg 组和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 组腹腔注射胍基丁胺 1.25、2.5、5 mg/kg[9],Control 组和Propofol 组腹腔注射等量生理盐水。

1.3.2 跳台实验

将各组大鼠于实验前1 d 置于反应箱中适应3 min,实验时将大鼠放在平台上并接通铜栅电源,记录各组大鼠3 min 内错误次数;第2 天直接将大鼠放于接通铜栅电源的平台上,记录3 min 内错误次数。

1.3.3 2,3,5-三苯基氯化四氮唑法

处死所有大鼠,取脑,称取重量并石蜡包埋切片。 按照染液说明书,将新鲜脑组织切片置于装有TTC 染液的培养皿中,37℃避光孵育30 min,用组织冲洗应用液将组织表面多余染色液冲洗掉,正常脑组织呈玫瑰红色,梗死组织呈灰白色。 再将切片置于10%甲醛中固定24 h,称重,记为湿重;剥离梗死组织,与正常组织一起放入烘箱,烘至恒重,称重,记为干重。 然后计算大鼠脑含水率、脑指数。 脑含水率(%)=(湿重-干重)/湿重×100%,脑指数(%)=大脑重量/体重×100%。

1.3.4 脑损伤评分

通过Longa 法[10]对各组大鼠神经功能缺陷、姿势反射进行评分。

1.3.5 HE 染色

取各组大鼠脑组织石蜡包埋切片,采用苏木素-伊红(HE)染液,将石蜡切片脱蜡,蒸馏水润湿组织,核染液染色5 min,水洗5 s,浆染液染色30 s,水洗后,滤纸吸干,无水乙醇脱水2 次后封片,在荧光显微镜下观测。

1.3.6 Nissl 染色

取各组大鼠脑组织用10%福尔马林固定液固定,常规脱水,石蜡包埋,冠状切片,片厚5 μm,二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,Nissl 染色液染色,中性树脂封片,光镜下观察大脑海马组织尼氏小体变化。

1.3.7 Western blot

取各组大鼠脑组织用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取,BCA 试剂盒测定蛋白质含量。 提取等量的蛋白质样品在100℃条件下变性5 min。 然后使用SDS-PAGE 凝胶电泳法分离并转移至PVDF 膜,在4℃条件下加入相应一抗并孵育过夜,清洗,然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗,孵育 2 h,最后加入发光液,曝光处理。Image J软件统计灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。 符合正态分布的计量资料以平均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胍基丁胺降低丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型犯错次数、脑含水率和脑指数

通过跳台实验检测各组大鼠犯错次数结果如图1A 所示,与Control 组相比较,Propofol 组犯错次数显著升高(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组犯错次数显著降低(P<0.05);通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑法检测各组大鼠脑含水率、脑指数结果如图1B、1C 所示,与Control 组相比较,Propofol 组脑含水率、脑指数显著升高(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组脑含水率、脑指数显著降低(P<0.05)。

注:A:犯错次数;B:脑含水率;C:脑指数。 1:对照组;2:丙泊酚组;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 组;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg组;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 组。 与 Control 组比较,∗P<0.05;与 Propofol 组比较,#P<0.05。图1 胍基丁胺对丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型犯错次数、脑含水率、脑指数的影响Note.A, number of mistakes.B, Cerebral water content.C, Cerebral index.1,Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ∗P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 1 Effects of guanidine on the number of errors, brain water content and brain index of propofol induced nerve injury in rat model

2.2 胍基丁胺降低丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型神经功能缺陷评分、姿势反射评分

通过Longa 法评价各组大鼠神经功能缺陷评分、姿势反射评分结果如图2A、2B 所示,与Control组相比较,Propofol 组神经功能缺陷评分、姿势反射评分显著升高(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组神经功能缺陷评分、姿势反射评分显著降低(P<0.05)。

2.3 胍基丁胺改善丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型病理损伤程度,升高BDNF、NGF 蛋白表达水平

通过HE 染色检测各组大鼠海马区病理损伤程度结果如图3A 所示,Control 组海马区神经元细胞排列整齐,结构清晰。 Propofol 组神经细胞排列紊乱,细胞形态发生变化,间隙增大,细胞核染色变深,核固缩。 Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组较 Propofol 组病理损伤程度均有不同程度明显改善。 通过Western blot 检测各组大鼠BDNF、NGF 蛋白表达水平结果如图3B 所示,与 Control 组相比较,Propofol 组 BDNF、NGF 蛋白水平显著降低(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组 BDNF、NGF蛋白水平显著升高(P<0.05)。

注:A:神经功能缺陷评分;B:姿势反射评分。 1:对照组;2:丙泊酚组;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 组;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 组;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 组。 与 Control 组比较,∗P<0.05;与 Propofol 组比较,#P<0.05。图2 胍基丁胺对丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型神经功能缺陷评分、姿势反射评分的影响Note.A,Neurologic deficit scores.B, Postural reflex score.1,Control group; 2, Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group;5,Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ∗P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 2 Effects of guanidine on scores of neural functional defects and postural reflex in propofofo induced nerve injury rats

注:A:HE 染色检测海马区病理损伤;B:BDNF、NGF 蛋白表达。 1:对照组;2:丙泊酚组;3:丙泊酚+胍基丁胺1.25 mg/kg 组;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 组;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 组。 与 Control 组比较,∗P<0.05;与 Propofol 组比较,#P<0.05。图3 胍基丁胺对丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型病理损伤程度和BDNF、NGF 蛋白表达水平的影响Note.A, HE staining was used to detect pathological damage in the hippocampus.B, protein expression of BDNF and NGF.1, Control group; 2,Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group; 5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ∗P<0.05; Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 3 Effects of guanidine on the degree of pathological damage and the expression levels of BDNF and NGF proteins in propofofo-induced nerve injury rat models

2.4 胍基丁胺抑制丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型海马区组织凋亡,降低Bax/Bcl-2 比值

通过Nissl 染色检测各组大鼠海马区组织凋亡情况结果如图4A 所示,与 Control 组相比较,Propofol 组大鼠Nissl 小体数目明显减少,而Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组相比较 Propofol 组 Nissl小体数目明显增多,说明胍基丁胺可以作用海马体,提高神经元的存活;通过Western blot 检测各组大鼠Bax、Bcl-2 蛋白表达水平结果如图4B 所示,与Control 组相比较,Propofol 组 Bax/Bcl-2 比值显著升高(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组 Bax/Bcl-2 比值显著降低(P<0.05)。

2.5 胍基丁胺升高丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表达水平

通过 Western blot 检测各组大鼠 Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达水平结果如图5 所示,与Control 组相比较,Propofol 组p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平显著降低(P<0.05)。 与 Propofol 组相比较,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 组 p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平显著升高(P<0.05)。

注:A:Nissl 染色检测海马区组织细胞凋亡;Bax、Bcl-2 蛋白表达。 1:对照组;2:丙泊酚组;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 组;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 组;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 组。 与Control 组比较,∗P<0.05;与Propofol 组比较,#P<0.05。图4 胍基丁胺对丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型海马区组织凋亡和Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的影响Note.A, Nissl staining was used to detect the apoptosis of hippocampal tissue cells.Expression of Bax and Bcl-2 proteins.1, Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ∗P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 4 Effects of guanidine on propofol induced hippocampal tissue apoptosis and Bax and Bcl-2 protein expression levels in rats with nerve injury

注:A: Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达;B:Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达直方图。 与Control 组比较,∗P<0.05;与 Propofol 组比较,#P<0.05。图5 胍基丁胺对丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达水平的影响Note.A, Nrf2, p-Nrf2, HO-1 protein expression.B, the protein expression histogram of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1.Compared with Control group, ∗P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 5 Effects of guanidine on the expression levels of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1 proteins in propofol induced nerve injury rat models

3 讨论

本研究显示,胍基丁胺具有降低丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型犯错次数、脑含水率和脑指数的作用。 犯错次数的降低表明大鼠被动记忆能力升高。 脑指数的升高反映了脑水肿的严重程度,控制脑水肿可以改善神经损伤。 表明胍基丁胺能有效缓解丙泊酚诱导的神经损伤大鼠脑水肿。

神经功能缺陷评分是评价大鼠学习记忆能力的重要方法[11]。 由于脑损伤时可致姿势反应性异常,出现异常姿势、异常姿势反射和异常运动,姿势反射评分可早期发现脑损伤[12]。 本文研究结果说明,应用丙泊酚会对幼年大鼠学习记忆功能产生明显影响。 而腹腔注射胍基丁胺后神经功能缺陷评分和姿势反射评分降低,则表明胍基丁胺改善丙泊酚诱导的神经损伤大鼠的神经功能。

脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)是中枢神经级联信号传递的关键分子,能促进神经突触生长而建立神经元和靶细胞之间的突触联系[13]。 BDNF 参与中枢神经系统神经元的生长、发育、分化、再生以及修复,维持成熟神经元功能, 防止神经元坏死及凋亡[14]。BDNF 可作为判定幼儿脑损伤的的检测指标。 NGF则是中枢神经系统重要的神经营养因子,在神经元保护和神经损伤后功能重建等方面起重要作用。王宏燕等[15]研究发现严重神经元损伤可造成神经元NGF、BDNF 表达下调,可通过升高NGF 和BDNF等神经营养因子表达修复大脑海马区神经元。 本文研究发现,胍基丁胺具有升高丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型BDNF、NGF 蛋白表达水平的作用。提示胍基丁胺改善丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型神经元损伤。

注射丙泊酚可增加大鼠海马细胞凋亡的频率,由于丙泊酚对不同物种的未成熟神经元有不利影响,即使使用亚麻醉剂量的丙泊酚进行治疗,也会在新生鼠的大脑皮层,尾状和壳状核中引起神经元凋亡[8]。 在本研究中,我们观察到尼氏小体在胍基丁胺药物组中增多,且Bax/Bcl-2 比值降低,Bax/Bcl-2 比值是决定细胞凋亡发生的关键指标[16]。 表明胍基丁胺可抑制丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型神经元细胞凋亡。

Nrf2 是一种体内的抗氧化转录因子,当机体受到不利刺激时在胞质中从Keap-1 上解离出来,启动下游 HO-1、NQO1 及 SOD 等抗氧化基因的转录[17]。 HO-1 在体内具有抗氧化、细胞保护作用,其降解血红素的产物代谢中可清除氧自由基、超氧阴离子,阻止蛋白、脂质过氧化。 在脑内激活Nrf2 途径能起到神经保护的作用[18]。 本文研究发现,胍基丁胺具有升高丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表达水平。 提示胍基丁胺通过调节Nrf2/HO-1 信号通路减轻丙泊酚诱导的新生大鼠的神经毒性。

综上所述,胍基丁胺具有降低丙泊酚诱导的神经损伤大鼠模型犯错次数、脑含水率、脑指数、神经功能缺陷评分、姿势反射评分、Bax/Bcl-2 比值,改善病理损伤程度,升高BDNF、NGF 蛋白表达水平,抑制海马区组织凋亡,这可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。